2024-03-28T10:56:05Z
http://opus.uni-hohenheim.de/oai2/oai2.php
oai:opus.uni-hohenheim.de:488
2010-08-30T14:45:40Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-4888
Glucocorticoid-induziertes Wachstum von Tumorzellen : systematische Quantifizierung, Signalmechanismen und Inhibition
Glucocorticoid-induced growth of tumour cells : systematic quantification, signalling mechanisms and inhibition
Universität Hohenheim
Glucocorticosteroide
Tumorzelle
Proliferation
Life sciences
Signalmechanismen
p38-MAPK
Akt
Inhibition
glucocorticoids
adverse drug effects
tumor cell proliferation
signalling mechanisms
kinase inhibitors
Glucocorticoide (GC) wie Dexamethason (Dex) werden in der Tumortherapie häufig
eingesetzt, zum einen als Zytostatika zur Behandlung hämatopoetischer Tumoren
und zum anderen als Adjuvantien zur Reduktion von Nebenwirkungen in der
Behandlung solider Tumoren. In den letzten Jahren wurde jedoch gezeigt, dass GC
die Wirkung von Zytostatika auf Zellen solider Tumore abschwächen können. Durch
Vorarbeiten in unserer Arbeitsgruppe kam der Verdacht auf, dass GC in der Lage
sind, Proliferation von Tumorzellen zu induzieren.
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die GC-induzierte Proliferation von
Tumorzellen systematisch untersucht. Das beschleunigte Tumorzellwachstum wurde
mittels repetitiver Mikroskopie, Impedanzanalyse, Bestimmung der DNASyntheserate, der enzymatischen Aktivität sowie der absoluten Zellzahl validiert. Eine Quantifizierung ergab, dass 6 von 10 Zelllinien verschiedenster solider Tumoren mit Proliferation auf GC reagierten. Darüber hinaus konnten die in vitro erhobenen pro-proliferativen Effekte der GC durch einen Tierversuch mit einer Lungenkarzinomzelllinie ebenfalls in vivo bestätigt werden. Des Weiteren wurden 139 primäre Proben von Kindern mit akuter Leukämie getestet und bei 15% der Proben ein Überlebensvorteil der Tumorzellen durch GC gemessen; eine Probe zeigte sogar GC-induzierte Proliferation. Demzufolge konnte der anti-apoptotische und pro-proliferative Effekt von GC nicht nur auf etablierten Zelllinien solider Tumore, sondern auch auf primären hämatopoetischen Tumorzellen nachgewiesen werden.
Knockdown-Studien in Zellen solider Tumoren zeigten eine wichtige Rolle des
Glucocorticoidrezeptors für die GC-induzierte Proliferation, welche des Weiteren
durch die beiden Proteinkinasen Akt und p38-MAPK vermittelt wurde. GC-induzierte
Proliferation konnte durch Apoptoseinduktion verhindert werden, die einerseits durch klinisch einsetzbare Substanzen, wie beispielsweise Vincristin herbeigeführt wurde, andererseits durch induzierbare Expression des pro-apoptotischen Moleküls Caspase-3.
Zusammenfassend charakterisiert die vorliegende Arbeit GC-induzierte Proliferation von Tumorzellen als neue, Tumorzell-gerichtete Nebenwirkung von GC. Die Daten sprechen für einen zurückhaltenden Einsatz von GC während der
Tumortherapie sowie für die Durchführung weiterführender präklinischer und
klinischer Studien, die einen effektiveren und sichereren Einsatz von GC während
der Tumortherapie aufzeigen.
Glucocorticoids (GCs) like Dexamethasone (Dex) are widely used in cancer patients, as cytotoxic drugs in hematopoetic tumors or adjuvants in solid tumors to reduce severe side effects. Nevertheless, GCs are accused to reduce anti-cancer treatment efficiency. Due to preliminary works in our research group the suspicion arose that GCs are able to induce proliferation of tumor cells.
The present work provides the first systematic quantification of the proproliferative effects of GCs on tumor cells. Enhanced tumor cell growth was validated by repetitive microscopy, impedance analysis, investigation of DNA synthesis rate, enzymatic activity as well as absolute cell number. It could be proven that 6 out of 10 cell lines from solid tumors showed enhanced proliferation after stimulation with Dex, whereas this phenotype was not limited to one tumour entity or a common origin. In vivo, Dex significantly promoted tumor cell growth in a preclinical mouse model with a lung carcinoma cell line. Furthermore the effect of GCs was detected on 139 primary, patient-derived acute childhood leukemia cells. In 15% GCs were able to increase the in vitro survival of the tumor cells and one sample showed even GC-induced proliferation. Accordingly the anti-apoptotic and pro-proliferative effects of GCs could be proven not only on established solid tumor cell lines but also on primary hematopoetic tumor cells.
Knockdown studies in cells of solid tumors showed that GC-induced proliferation was mediated by the glucocorticoid receptor and was further transmitted by the proteinkinases Akt and p38-MAPK. GC-induced proliferation could be prevented by induction of apoptosis which was caused either by clinically applicable substances, as for example Vincristine, or by inducible expression of the pro-apoptotic molecule Caspase-3.
To sum up, the present work identified GC-induced proliferation of tumor cells as a new, tumor cell directed side effect of GCs. Of direct translational relevance, our data argue towards a restricted use of GCs during anti-cancer therapy as well as the need for preclinical and clinical studies which demonstrate a more effective and safer application of GCs during anti-cancer therapy.
1283172340
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/488/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/488/pdf/Dissertation_Sibylle_Guendisch.pdf
Gündisch, Sibylle
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Biologische Chemie und Ernährungswissenschaft
oai:opus.uni-hohenheim.de:489
2010-08-31T07:44:04Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-4894
Vakzinierungsstrategien gegen eine Echinococcus multilocularis-Infektion zur Charakterisierung protektiver Immunantworten
Vaccination strategies against an Echinococcus multilocularis infection to characterize protective immune responses
Universität Hohenheim
Fuchsbandwurm
Impfstoff
Antigen
Salmonella typhimurium
Immunreaktion
Life sciences
EM95
EMGAPDH
Echinococcus multilocularis
immunization
Salmonella typhimurium
EM95
EMGAPDH
Die Larvalstadien von Echinococcus multilocularis verursachen beim Menschen das Krankheitsbild der alveolären Echinokokkose (AE), welches laut WHO die gefährlichste parasiten-induzierte Zoonose in Mitteleuropa darstellt. Weitere Erkenntnisse über Infektionsverlauf und mögliche protektive Mechanismen gegen eine Infektion mit diesem Zestoden sind daher von großem Wert.
In beinahe allen vorangegangenen Infektionsstudien mit Echinococcus multilocularis im Zwischenwirt wurde die Methode der sekundäre Echinokokkose als Infektionsweg gewählt. Da diese nicht dem natürlichen Verlauf entspricht, können resultierende Immunantworten, insbesondere in der Frühphase der Infektion, nicht ohne Einschränkungen auf die einer primären alveolären Echinokokkose übertragen werden. In der vorliegenden Arbeit die Methode der primären AE durchgeführt. Die Antigene EM95 und EMGAPDH wurden einerseits in einer konservativen Vakzinierungsstrategie als aufgereinigte Proteine in Verbindung mit einem Adjuvans subkutan appliziert, andererseits wurde ein System entwickelt, in welchem diese Antigene von Salmonellen exprimiert und im Falle von EM95 durch das HämolysinA-Transportsystems erfolgreich exportiert werden.
In zwei unabhängigen Immunisierungsstudien, in welchen EMGAPDH mit Saponin als Adjuvans subkutan appliziert wurde, konnte eine signifikante Reduktion der Zystenbildung erzielt werden. Die Parasitenbürde verringerte sich gegenüber den infizierten Kontrolltieren um 76,4% im ersten Versuch und 86,1% im zweiten Versuch.
Durch die subkutane Immunisierung mit dem Antigen EM95 konnte die Parasitenlast in zwei Versuchen um 96,9% bzw. 98,4% gegenüber den infizierten Kontrolltieren verringert werden. Ein Einfluss der sekretorischer Einheit und der Transmembrandomain von EM95 kann aufgrund der hier durchgeführten Studien ausgeschlossen werden.
Die subkutanen Immunisierungen mit den rekombinanten Antigenen EM95 und EMGAPDH induzierten einen hohen Antikörpertiter gegen diese Proteine, welche vorwiegend auf den IgG-Subklassen IgG1 und IgG2a beruhten. E. multilocularis - Gesamtantigen ? spezifische Antikörper konnten nach 4wöchiger Infektionsdauer weder bei geschützten Tieren noch den infizierten Kontrollgruppen festgestellt werden.
Aufgrund der erhöhten Ausschüttung von IFNγ nach Immunisierung mit den rekombinanten Antigenen EM95 und EMGAPDH scheint eine Beteiligung von zytotoxischen T-Zellen und NK-Zellen an den protektiven Immunmechanismen gegen eine Infektion mit E. multilocularis höchst wahrscheinlich. Werden die hier untersuchten immunologischen Parameter der vakzinierten Tiere zusammengefasst, beruhen die protektiven Mechanismen auf eine Th1-geprägte Immunantwort. Eine Beteiligung von Th2-Komponenten ist jedoch denkbar, da zumindest in einem Teil der Studien eine Detektion von IL-10 erfolgte und eine ausgeprägte IgG1 Antikörper-Bildung nach Immunisierung stattfand.
Durch den Einsatz des Plasmides pVDL9.3 gelang es in dieser Arbeit erstmalig das Metazooen-Protein EM95 des Zestoden Echinococcus multilocularis erfolgreich mittels des HämolysinA-Systems aus dem Vektor Salmonella typhimurium zu exportieren.
Durch die Immunisierung mit ZpVDL9.3EM95 konnte in einer Studie eine 78%ige Reduktion der Metazestodenlast gegenüber der infizierten Kontrollgruppe erzielt werden. Mäuse, welche mit dem EMGAPDH exprimierenden Salmonellen-Stamm ZpVDL9.3EMGAPDH immunisiert wurden, bildeten 73% weniger Zysten aus. In einem weiteren Versuch, in dem zu dem Salmonella-Vektor ZpVDL9.3EMGAPDH eine weitere subkutane Immunisierung mit EMGAPDH erfolgte, erzielte eine Abnahme der Metazestodenbildung um 87%. Eine Kontroll-Immunisierung mit S. typhimurium führte ebenfalls zu einer signifikanten Reduktion der Metazestodenlast um 68%. Eine Bildung von Antikörpern gegen die E. multilocularis ? Antigene EM95 und EMGAPDH konnte nach Immunisierung mit den Salmonella-Vektoren nicht nachgewiesen werden. Die Antikörperbildung gegen S. typhimurium dagegen war deutlich ausgeprägt.
Eine subkutane Immunisierung post infectionem mit EM95 und Saponin als Adjuvans zu den Zeitpunkten 4dpi, 7dpi, 24dpi und 60dpi führte weder zu einer Reduktion der Metazestodenlast, noch wurde eine Veränderung in der Größe der einzelnen Zysten festgestellt.
Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse hinsichtlich der schützenden Eigenschaften von EM95 und EMGAPDH unter Anwendung des natürlichen Infektionsmodus erhöhen das Verständnis protektiver Immunmechanismen gegen eine Echinococcus multilocularis Infektion. Die Konstruktion eines Immunisierungssystems in Form einer Salmonella typhimurium ? Lebendvakzine, welche Metazoen-Antigene exportiert, eröffnet neue Möglichkeiten für zukünftige Immunisierungenansätze gegen diverse Parasiten.
The larval stages of Echinococcus multilocularis are the causative agents of the human alveolar echinococcosis (AE), which is according to the WHO the most important parasite-induced zoonosis in middle Europe. Additional knowledge about the infection process and possible protective mechanisms against an infection with this cestode would be of great value.
Almost all previous studies about Echinococcus multilocularis infections in the intermediate host were carried out by using the secondary echinococcosis as route of infection. This route of infection doesn?t correspond to the natural route, the oral uptake of Echinococcus eggs resulting in a primary alveolar echinococcosis. Thereby the resulting immune responses of the secondary AE cannot be converted without reservations to the primary AE, especially in the early stages of the infection. On that account the primary AE was carried out in this study.
On the one hand a conservative vaccination with purified antigen EM95 and EMGAPDH in combination with an adjuvant was subcutaneous administered and on the other hand a system was developed in which the antigen EM95 were expressed by salmonellae and exported via the hemolysinA-transport system.
A significant reduction of the formation of cysts could be achieved in two separate immunisation trials with EMGAPDH combined with the adjuvant Saponin which was administered subcutaneously. The manifestation of cysts was reduced by 76.4 % in the first and 86.1 % in the second trial compared to the infected control group.
The subcutaneous immunisation with the antigen EM95 reduced the manifestation of cysts even by 96.9 % and 98.4 % respectively. Sixty percentages of the animals showed a complete protection against an infection with E. multilocularis in both trials. Based of the experiments which were carried out during this study, the influence of the secretory unit or the transmembrane domain of EM95 can be excluded.
The subcutaneous immunisation with the recombinant antigens EM95 and EMGAPDH induced a high antibody titre against those proteins, which based predominantly on the IgG-subclasses IgG1 and IgG2a. The detection of specific antibodies against E. multilocularis crude antigen after duration of infection of 4 weeks was neither in protected animals nor in the infected control group possible. The vaccination trials with the recombinant antigens EM95 and EMGAPDH lead us to the conclusion that the murine immune system was stimulated to detect suitable target epitopes of the oncosphere surface and to destroy these oncospheres by classical complement activation.
It seems very probable that cytotoxic T-cells and natural killer cells are involved in the protective immune mechanisms against an E. multilocularis infection owing to the finding of an increased release of IFNγ as a result of an immunisation with the recombinant antigens EM95 and EMGAPDH. Summarizing the investigated immunological parameters, the protective mechanisms are based on a Th1 associated immune response. Nevertheless, an involvement of Th2 components is conceivable due to the fact that at least in parts of the study the cytokine IL-10 and a distinct IgG1 antibody response could be detected past the immunisation.
By the use of the plasmid pVDL9.3 we succeeded for the first time to manipulate Salmonella typhimurium to export the metazoan protein EM95 via the hemolysinA-system.
The immunisation with ZpVDL9.3EM95 resulted in a reduction of manifested cysts by 78 % compared to the infected control group. Mice immunized with ZpVDL9.3EMGAPDH, where an export was not accomplished, showed a decrease in cysts manifestation by 73 %. The amount of cysts could be further reduced up to 87 % by the combined immunisation with the Salmonella vector ZpVDL9.3EMGAPDH and a subcutaneous application of EMGAPDH. A significant reduction of cysts (68 %) could be also observed by the control immunisation with plain S. typhimurium. Antibodies against the E. multilocularis antigens EM95 and EMGAPDH could not be detected after the immunisation with the Salmonella vectors. However, the antibody formation against S. typhimurium was strongly developed.
A subcutaneous post infection immunisation trial with EM95 in combination with the adjuvant Saponin at the time of 4dpi, 7dpi, 24dpi and 60dpi led neither to a reduction of the amount of cysts nor to a change in size of the developed cysts.
The gained insights of this study into the protective potential of EM95 and EMGAPDH on the basis of a natural infection rout expand the knowledge and understanding about the protective immune mechanisms against an Echinococcus multilocularis infection. The development of an immunisation system in form of a Salmonella typhimurium live vaccine, with the ability of exporting metazoan antigens, opens up new possibilities of immunisation strategies against diverse parasites in future.
1283233398
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/489/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/489/pdf/T.Wassermann_Promotionsarbeit.pdf
Wassermann, Torsten
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Zoologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:492
2010-09-09T07:34:15Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-4927
Exzitatorische Pharmakologie der retinalen Spreading Depression
Excitatory pharmacology of the retinal spreading depression
Universität Hohenheim
Spreading depression
Dopamin
Serotonin
Noradrenalin
Netzhaut
Acetylcholin
Zentralnervensystem
Life sciences
exzitatorisch
Retina
Spreading Depression
CNS
Das Phänomen der Spreading Depression (SD) ist eine sich wellenförmig ausbreitende Unterdrückung neuronaler Aktivität, die in der grauen Substanz des Zentralen Nervensystems auftritt. Dies resultiert aus einer massiven Ionenumverteilung an der Zellmembran, bei der Kalium-Ionen aus der Zelle hinausströmen und Natrium-, Chlorid- und Calcium-Ionen in die Zelle hineinströmen. Dabei kommt es zu einer langsamen negativen Potentialverschiebung von bis zu 30mV. Das Phänomen der Spreading Depression lässt sich auch in der Retina, einem Teil des ZNS, hervorrufen, und kann sehr gut mit dem bloßen Auge beobachtet werden. Die Wirkung exzitatorischer Pharmaka auf neuronales Gewebe am Modell der retinalen Spreading Depression ist Thema der vorliegenden Arbeit.
Durch die Applikation der unterschiedlichen exzitatorischen Substanzen lässt sich eine Abnahme der Ausbreitungsgeschwindigkeit sowie eine Reduktion der Leitfähigkeit der Membranen feststellen. Dies wird im Falle von Nikotin vermutlich durch die Desensitisierung der nikotinischen Acetylcholinrezeptoren verursacht. Bei Koffein, Kokain, Amphetamin und Methylphenidat liegt die Wirkung vermutlich in der, durch geöffnete Kationenkanäle begründeten, Hyperpolarisation des Gewebes. Die Latenz, ein Parameter für die Erregbarkeit des Gewebes, nimmt bei allen applizierten Substanzen zu. Dies ist vermutlich ebenso in der Desensitisierung der nACh-Rezeptoren bzw. der Hyperpolarisation des Gewebes begründet. Für alle Substanzen konnte eine neuroprotektive Wirkung gegen den, durch NMDA-Rezeptoren vermittelten, exzitotoxischen Zelltod nachgewiesen werden. Bei Nikotin geht man von einer Beteiligung der α7- und α4β2-nACH-Rezeptoren aus, jedoch ist der zugrunde liegende Mechanismus noch nicht aufgeklärt. Eine mögliche Erklärung ist jedoch in der reduzierten Erregbarkeit des neuronalen Gewebes durch die Desensitierung der nACh-Rezeptoren zu finden. Bei den übrigen untersuchten Substanzen liegt die Annahme einer neuroprotektiven Wirkung durch die im synaptischen Spalt verbleibenden Transmitter nahe. Die daraus resultierende Hyperpolarisation hat eine geringere Erregbarkeit des neuronalen Gewebes zur Folge und verhindert somit sehr wahrscheinlich eine Übererregung des Gewebes.
The phenomenon of Spreading Depression (SD) is a suppression of neuronal activity, propagating wave-like in the grey matter. This results from a massive ion translocation where potassium ions pour into the cell and sodium-, chlorideand calcium ions pour out of the cell. At the same time there is also a slow negative potential shift up to 30mV. Spreading Depression also occurs in the retina, a part of the central nervous system and can easily be observed there with the naked eye. This dissertation describes the effects of excitatory pharmaceuticals on neuronal tissue, using retinal spreading depression as a model system.
By applying different excitatory substances, a reduction of the velocity and an inhibitory effect on the conductivity of the membranes can be observed. In the case of nicotine this may be due to the desensitization of the nicotinic AChreceptors. For caffeine, cocaine, amphetamine and metylphenidate this effect may derive from the hyperpolarisation of the tissue through open cation channels. The latency, a parameter for the excitability of the tissue, increases with the application of any of the investigated substances. This is also caused by the desensitization of the nicotinic ACh-receptors or the hyperpolarisation of the tissue, respectively. A neuroprotective effect reducing excitotoxic cell death induced by activation of NMDA-receptors was successfully verified for all substances. In the case of nicotine, the α7- and α4β2-nACh-receptors are assumed to be involved. The basic mechanism however is still unknown. A possible explanation could be the reduced excitability of the tissue through desensitization of the nACh-receptors. In the case of the remaining substances, the abidance of transmitters in the synaptic cleft suggests a neuroprotective effect through hyperpolarisation. The resulting hyperpolarisation leads to a reduced excitability of the neuronal tissue and most likely prevents over-excitation.
1284008686
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/492/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/492/pdf/Dissertation_SD_Michaela_Sieber.pdf
Sieber, Michaela
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Physiologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:497
2010-09-15T12:59:04Z
ddc:570
pub-type:8
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Herstellung und Charakterisierung einer rekombinanten, sequenzspezifischen Protease zur Generierung bioaktiver Peptide
Production and characterisation of a recombinant, sequence specific protease to generate bioactive peptides
Universität Hohenheim
Peptide
Life sciences
Lysyl-Endopeptidase
Endoprotease LysC
Lysobacter enzymogenes
Caseinhydrolyse
bioaktive Peptide
lysyl-endopeptidase
endoprotease lysC
Lysobacter enzymogenes
casein hydrolysis
bioactive peptides
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine sequenzspezifische, mikrobielle Protease herzustellen, biochemisch zu charakterisieren und mittels dieses Enzyms aus Lebensmittelprotein hydrolytisch bioaktive Peptide zu generieren. Um die Serin-Protease PRT1 aus Xanthomonas campestris pv. campestris bezüglich ihrer Substratspezifität zu untersuchen, wurde dieser Stamm im Schüttelkolben kultiviert. Nach Dialyse des Kulturüberstandes und Zugabe von 1,10-Phenantrolin zur Inaktivierung der Metalloprotease PRT2 konnte eine Enzymaktivität von 0,34 nkat Casein/mL detektiert werden. Der Umsatz verschiedener chromogener Peptidsubstrate zeigte, dass PRT1 keine eindeutige Substratspezifität aufweist. Die Lysyl-Endopeptidase LysC aus Lysobacter enzymogenes ssp. enzymogenes wurde durch Kultivierung des Wildstamms (ATCC 27796) gewonnen. Im Bioreaktor(1 L Arbeitsvolumen) konnte nach 45 h eine maximale Protease-Aktivität von 0,084 nkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/mL im Kulturüberstand nachgewiesen werden. Das LysCGen wurde mittels PCR aus genomischer DNA amplifiziert und in den E. coli Expressionsvektor pET20b(+) kloniert. Die Expression in E. coli BL21(DE3) führte jedoch zu keiner nachweisbaren Bildung von rekombinanter Protease. Daher wurde ein bereits in der Literatur beschriebenes, synthetisches Genkonstrukt mit verkürzter N-terminaler Prosequenz (MGSK) und an E. coli angepasster ?Codon Usage? für die heterologe Expression untersucht. Die Bioreaktor-Kultivierung (5 L Arbeitsvolumen) von E. coli BL21(DE3) pET20b-MGSK-LysC führte zu rekombinanter LysC, welche in Form von ?Inclusion Bodies? in den Zellen gebildet wurde. Die Solubilisierung der ?Inclusion Bodies? und anschließende Renaturierung des Enzyms mit L-Arginin als unspezifischer Faltungshilfe ergab eine maximale Proteaseaktivität von 0,06 nkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/L Kultur 5 h nach IPTG-Induktion. Um die Ausbeute an rekombinanter Proteaseaktivität steigern zu können, wurde der Einfluss der beiden LysC-Propeptide auf die in vitro Renaturierung der Protease untersucht. Hierfür wurden die Propeptid-DNA-Sequenzen aufgeklärt, kloniert und in E.coli heterolog exprimiert. Die Zugabe von C-terminalem und N-terminalem Propeptid zur LysC-Renaturierung führte zu einer bis zu 27fachen (1,56 Μkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/L Kultur) Steigerung der LysC-Aktivität bezogen auf die Renaturierung mit L-Arginin. Als alternatives ?Food-grade? Expressionssystem wurde das in der Literatur etablierte Expressionssytem von Lactobacillus plantarum NC8 bzw. L. sakei Lb790 und dem E. coli-Lactobacillus Shuttle-Vektor pSIP409 eingesetzt. Jedoch konnte weder bei der Schüttelkolben-Kultivierung von L. plantarum NC8 pSIP409-MGSK-LysC noch von L. sakei Lb790 pSIP409-MGSK-LysC rekombinante Lysyl-Endopeptidase nachgewiesen werden. Da als möglicher Grund hierfür die unterschiedliche ?Codon Usage? von E. coli und Lactobacillus angenommen wurde, wurden Expressions-Experimente mit punktmutierten Varianten des beta-Galactosidasegens aus Kluyveromyces lactis durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass der Austausch des Serin-Codons tca bzw. agt gegen tcc einen deutlichen Einfluss auf die resultierende Enzymaktivität hatte. So führte der dreifache Codon-Austausch zu einer Verringerung der beta-Galactosidase-Aktivität um 38 %. Die Charakterisierung der rekombinanten Lysyl-Endopeptidase LysC bestätigte die hohe Substratspezifität für Lysinreste an P1-Position. Das pH- bzw. Temperatur-Optimum lag bei 8,5 bzw. 45°C. Bei 4°C und pH 9 war das Enzym für mindestens 20,5 h stabil, während bei 45°C nach 1 h nur noch 40 % Restaktivität gemessen werden konnten. Eine inhibierende Wirkung auf LysC zeigten Ba2+, NH4+ und PMSF. Die Hydrolyse von bovinem Casein mit LysC generierte die ACE-inhibierenden Peptide EMPFPK, FALPQYLK, NMAINPSK und ALNEINQFYQK sowie das antioxidativ wirkende VLPVPQK, die alle eindeutig mittels LC-ESI-MS/MS detektiert werden konnten. Über entsprechende in vitro Assays wurden die Radikalfänger-Aktivität (IC50 = 4,85 Μg/mL), die Lipoxygenase-Inhibierung (IC50 = 23,6 Μg/mL) sowie die ACE-Inhibierung (IC50 = 2,78 Μg/mL) des Casein-Hydrolysat quantifiziert.
The aim of the present thesis was the production and biochemical characterization of a sequence specific microbial protease. This enzyme should be applied in food protein hydrolyzation in order to generate bioactive peptides. To determine the substrate specificity of serine protease PRT1 from Xanthomonas campestris pv. campestris this strain was cultivated in a shaking flusk. After dialysis of the culture broth and addition of 1,10-phenantroline for metalloprotease PRT2 inactivation an enzyme activity of 0,34 nkat Caseine/mL was detected. The conversion of several chromogenic peptide substrates revealed that PRT1 does not offer a clear substrate specificity. The lysyl endopeptidase LysC from Lysobacter enzymogenes ssp. enzymogenes was obtained by cultivation of the wild type strain (ATCC 27796). In a bioreactor (1 L scale) a maximum protease activity of 0,084 nkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/mL in the culture broth was detected after 45 h. The LysC gene was amplified by PCR using genomic template DNA and was cloned into the E. coli expression vector pET20b(+), leading to no detectable recombinant protease when expressed in E. coli BL21(DE3). Thus for the heterologous expression a synthetic gene construct was applied which was formerly described in literature. It contained a short N-terminal pro-sequence (MGSK) and a codon usage adapted to E. coli. The bioreactor cultivation (5 L scale) of E. coli BL21(DE3) pET20b-MGSK-LysC led to LysC inclusion bodies. The solubilization of the inclusion bodies and the following enzyme renaturation using L-arginine as an unspecific folding additive resulted in a maximum protease activity of 0,06 nkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/L Culture 5h after IPTG induction. To increase the yield of recombinant protease activity the influence of the LysC propeptides on the in vitro renaturation of the protease was investigated. For this purpose both pro-peptide DNAs were sequenced, cloned and heterologously expressed in E. coli BL21(DE3). The addition of C-terminal and N-terminal propeptide to the LysC renaturation led to a maximum of 27fold (1.56 Μkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/L Culture) LysC activity increasion compared to the L-arginine renaturation. As an alternative food-grade expression system the in the literature already established system of Lactobacillus plantarum NC8, L. sakei Lb790 and the E. coli-Lactobacillus shuttle vector pSIP409 was tested. However, the shaking flusk cultivations of neither L. plantarum NC8 pSIP409-MGSK-LysC nor L. sakei Lb790 pSIP409-MGSK-LysC led to detectable recombinant lysyl endopeptidase. As a possible reason therefor the different codon usage of E. coli and Lactobacillus was assumed. So expression experiments were performed using point mutated variants of the beta-galctosidase gene from Kluyveromyces lactis. It could be shown that the exchange of the serine codons tca/agt and tcc had a significant effect on the resulting enzyme activity. The exchange of three codons led to a decreation of beta-galactosidase activity of 38 %. The characterization of the recombinant lysyl endopeptidase LysC confirmed the high substrate specificity for lysine residues at P1 position. The pH and temperature optimum was 8.5 and 45°C, respectively. At 4°C and pH 9 the enzyme was stable for at least 20.5 h, whereas at 45°C only 40 % residual activity were detected after 1 h. An inhibiting effect on LysC was demonstrated for Ba2+, NH+ and PMSF. Hydrolysis of bovine caseine by LysC for generated the ACE inhibiting peptides EMPFPK, FALPQYLK, NMAINPSK and ALNEINQFYQK as well as the antioxidative VLPVPQK, which all were unambiguously identified by LC-ESI-MS/MS. Performing appropriate in vitro assays, the radical scavenging acticvity (IC50 = 4,85 Μg/mL), lipoxygenase inhibition (IC50 = 23,6 Μg/mL) and ACE inhibition (IC50 = 2,78 Μg/mL) of the caseine hydrolysate were quantified.
1284544028
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/497/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/497/pdf/Dissertation_ThomasHug.pdf
Hug, Thomas
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:500
2010-10-13T10:00:13Z
ddc:570
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Patch clamp experiments with human neuron-like cells under different gravity conditions
Universität Hohenheim
Patch-Clamp-Methode
Nervenzelle
Ionenkanal
Life sciences
Parabelflug
Neuronen
Patch clamp
parabolic flight
neurons
ion channels
Gravitation influences many physical, chemical and biological processes. Cells and their behaviour are no exception. The gravitational impact on the activity of neuronal cells is very important with the perspective of manned space missions. Previous experiments with vertebrates showed that the velocity of neuronal impulses (action potentials) in nerve fibres is decreasing under zero gravity and is increasing at high gravity. There are many theories about the changed properties of the nervous systems under zero gravity, but the molecular principles are mostly unexplored.
For this dissertation hardware for patch clamp experiments under microgravity was developed. The patch clamp technique is a common used tool in investigating the electrophysiological properties of cells and single ion channels. Since the conditions during parabolic flights render classic patch clamp nearly impossible, advanced chip-based planar patch-clamp hardware, the Port-a-Patch from Nanion Technologies was integrated into a setup. This setup had to comply with the mandatory design and safety regulations to be used in parabolic flights. Two parabolic flight campaigns were used to validate the hardware, adapt the patch clamp procedures to the special conditions during a parabolic flight (as time pressure and vibrations) and to choose a suitable cell line from the available cell lines. As the laboratory conditions on ground were insufficient at the beginning of the project, the main focus had to lie on robust cells. The SH-SY5Y cell line was chosen for their robustness (they already have been used successfully by other teams) and their origin from the human brain (glioblastoma).
During two subsequent parabolic flight campaigns patch clamp experiments were performed and whole cell currents of SH-SY5Y cells were recorded with increasing success rate. Pulse protocols were used to create current-voltage (I-V) characteristics. To obtain 20 seconds of microgravity, two phases of hypergravity, each lasting 20 seconds, had to be endured by the passengers. This fact allowed the subsequent recording of whole cell currents of the same cell during normal Gravity (1g), hypergravity (1.8g) and microgravity (approx. 10-3g) to compare the I-V characteristics of the different gravity conditions.
For SH-SY5Y cells it was shown that a gravity dependence of the whole cell currents exists. The micro- and hypergravity whole cell currents were changed compared to 1g flight controls. At -20 and -10mV, the hypergravity current was significantly decreased compared to 1g, by 13.5% at -20mV and by 7.4% at -10mV.
A significant 1.8g current < 0g current relation could be observed at potentials between -20 and +10mV. At -20mV the microgravity whole cell currents were increased by 13.5%, at -10mV by 7.4%, at 0mV by 6.2% and at +10mV by 3.9%.
The duration and complexity of the used pulse protocols were limited by the time of each gravity phase (20-22 seconds).
In a last parabolic flight campaign, therefore the passive electrophysiological properties of the cell membrane were investigated. As the laboratory conditions at the site were greatly improved in the meantime, especially for cell culture, new cell lines could be tested for their usability. SNB19 cells, also originating from the human brain (astrocytoma) were chosen due to their good sealing quality and stability compared to SH-SY5Y cells and constant pulse protocols near the estimated resting potential (-80 and -60mV) were performed.
At constant -80mV and -60mV, it was shown that the whole cell currents during the variable gravity conditions are significantly increased compared to the 1g in-flight controls. The hypergravity current of SNB19 was increased by 2.2% at -80V and by 8.2% at -60mV. The microgravity current was increased by 4.1% at -80mV and 3.7% at -60mV.
The acquired I-V characteristic of SNB19 differs from the I-V characteristic of SH-SY5Y.
These findings show that the planar patch clamp technique can be used in parabolic flights to investigate the electrophysiological properties of single. Furthermore the findings suggest that the electrophysiological properties of single cells originating from the human brain exist are gravity dependent.
Die Schwerkraft beeinflusst viele physikalische, chemische und biologische Prozesse. Zellen und ihr Verhalten bilden dabei keine Ausnahme. Der Einfluss der Gravitation auf die Aktivität neuronaler Zellen ist wichtig, vor allem auch im Ausblick auf bemannte Weltraummissionen.
Frühere Experimente mit Wirbeltieren zeigten, dass die Leitungsgeschwindigkeit von Nervenfasern für Aktionspotentiale unter Schwerelosigkeit abnimmt und unter hoher Schwerkraft zunimmt. Es gibt viele Theorien über die veränderten Eigenschaften des Nervensystems in der Schwerelosigkeit, aber die molekularen Grundlagen sind bis heute weitgehend unbekannt.
Für diese Arbeit wurde die Hardware für ein Patch Clamp System entwickelt, welches in der Schwerelosigkeit eingesetzt werden kann. Die Patch Clamp Technik ist ein verbreitetes Werkzeug um die elektrophysiologischen Eigenschaften von Zellen und einzelnen Ionenkanälen zu untersuchen. Da die Bedingungen während eines Parabelfluges klassisches Patchen beinahe unmöglich machen wurde ein planares Patch Clamp System, der Port-a-Patch von Nanion, in einen Experimentaufbau integriert. Der Experimentaufbau wurde nach den Konstruktions- und Sicherheitsregeln entwickelt und gebaut, die für die Teilnahme an Parabelflügen vorgeschrieben waren. Zwei Parabelflugkampagnen wurden verwendet um den Entwurf bezüglich Funktionalität und Sicherheit zu validieren. Des Weiteren wurden die Patch Clamp Prozeduren an die speziellen Bedingungen während des Parabelflugs (wie Zeitdruck und Vibrationen) angepasst, und eine passende Zelllinie wurde aus den zur Verfügung stehenden Kulturen ausgewählt. Da die Laborbedingungen vor Ort zu Beginn des Projekts nicht ausreichend waren musste das Hauptaugenmerk auf der Unempfindlichkeit der Zelllinie liegen. Die Zelllinie SH-SY5Y wurde aufgrund ihrer Robustheit (sie wurde bereits von anderen Gruppen erfolgreich verwendet) und ihrem Ursprung aus dem menschlichen Hirn (Glioblastom) ausgewählt.
Während zwei folgender Parabelflugkampagnen wurden Patch Clamp Experimente mit steigender Erfolgsrate durchgeführt und Ganzzellströme von SH-SY5Y Zellen wurden aufgezeichnet. Spannungsprotokolle wurden verwendet um Strom-Spannungs-Kennlinien (I-V) zu erstellen. Um 20 Sekunden Schwerelosigkeit im Flugzeug zu erhalten waren zwei Hypergravitationsphasen, jeweils 20 Sekunden lang, notwendig. Dies wiederum ermöglichte die aneinandergereihte Aufnahme von Ganzzellströmen derselben Zelle während normaler Schwerkraft, Hypergravitation (1.8g) und Mikrogravitation (ca. 10-3g). Dadurch konnten die
I-V-Kennlinien der einzelnen Gravitationsphasen miteinander verglichen werden.
Für SH-SY5Y Zellen konnte gezeigt werden, dass eine Schwerkraftabhängigkeit der Ganzzellströme existiert. Verglichen mit den 1g-Kontrollen während des Fluges änderten sich die Ganzzellströme während der veränderten Schwerkraftbedingungen. Bei -20 und -10mV waren die Ganzzellströme signifikant erniedrigt, um 13,5% bei -20mV und um 7,4% bei -10mV.
Ein signifikantes 1.8g-Ströme < 0g-Ströme Verhältnis konnte zwischen -20 und +10mV beobachtet werden. Im Vergleich zu den Mikrogravitations-Strömen waren die 1.8g-Ganzzellströme bei -20mV um 13,5%, bei -10mV um 7,4%, bei 0mV um 6,2% und bei +10mV noch um 3,9% vergrößert.
Die verwendeten Spannungsprotokolle wurden in ihrer Dauer und Komplexität durch die Länge der einzelnen Gravitationsphasen (20-22 Sekunden) limitiert.
In einer letzten Parabelflugmission wurden deshalb die passiven elektrophysiologischen Eigenschaften der Zellmembran untersucht. Da sich inzwischen die Laborbedingungen vor Ort, vor allem für Zellkulturen, stark verbessert hatten konnten neue Zelllinien getestet werden. SNB19 Zellen, die ihren Ursprung ebenfalls im menschlichen Hirn (Astrozytom) haben, wurden aufgrund ihres, im Vergleich zu SH-SY5Y, sehr guten Sealverhaltens (Wahrscheinlichkeit und Stabilität) ausgewählt. Es wurden konstante Pulsprotokolle nahe des vermuteten Ruhepotentials (-80 und -60mV) von SNB19 Zellen durchgeführt.
Bei -80 und -60mV konnte gezeigt werden, dass die Ganzzellströme von SNB19 Zellen unter Hyper- und Mikrogravitation verglichen mit den 1g-Flugkontrollen signifikant erhöht sind. Die 1,8g-Ganzzellströme waren bei -80MV um 2,2% erhöht, bei -60mV um 8,2%. Die Ströme unter Mikrogravitation waren bei -80mV um 4,1%, bei -60mV um 3,7% erhöht.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die planare Patch Clamp Technik im Rahmen von Parabelflugmission erfolgreich verwendet werden kann um die elektrophysiologischen Eigenschaften von einzelnen Zellen zu untersuchen. Weiterhin legen die Ergebnisse nahe, dass die elektrophysiologischen Eigenschaften von Zellen, welche ihren Ursprung im menschlichen Gehirn haben, gravitationsabhängig sind.
1286952353
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/500/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/500/pdf/Diss_Kohn.pdf
Kohn, Florian Peter Michael
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Physiologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:520
2010-11-23T14:15:22Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-5205
Variabilität und Induzierbarkeit von Cytochrom P450 Monooxygenasen in humanen Leberproben und Hepatozyten : Untersuchungen mittels LC-MS/MS Cocktail-Assay und RNA-Interferenz
Variability and induction of cytochrome P450 monooxygenases in human liver samples and hepatocytes : analysis using LC-MS/MS cocktail-assay and RNA-interference
Universität Hohenheim
Cytochrom P-450
Enzyminduktion
RNS-Interferenz
Life sciences
P450 Aktivität
CYP Induktion
humane Hepatozyten
RNA-Interferenz
Statine
P450 activity
CYP induction
human hepatocytes
RNA-interference
statins
Die Variabilität der Expression und Funktion der P450 Enzyme (CYPs) ist eine der Ursachen dafür, dass bei gleicher Dosierung eines Medikaments Intensität und Dauer von Wirkungen und Nebenwirkungen von Patient zu Patient unterschiedlich sein können. Diese interindividuelle Variabilität der Enzyme lässt sich heute noch nicht lückenlos erklären. Prinzipiell können biologische Faktoren (z.B. Alter, Geschlecht, Hormonstatus), Umweltfaktoren (Ernährung, Rauchen, Arzneimittelinteraktionen) sowie genetische Faktoren, z.B. Polymorphismen, Enzymfunktionen beeinflussen.
Um dieser Problematik nachgehen zu können und auf Aktivitätsebene relativ schnell und einfach Unterschiede nachzuweisen, wurde ein LC-MS/MS basierter P450 Cocktail-Assay zur Quantifizierung der sieben wichtigsten Enzymaktivitäten für den Arzneistoffwechsel entwickelt und in humanen Hepatozyten etabliert.
Am Beispiel der Arzneistoffgruppe der HMG-CoA Reduktasehemmer (Statine) wurden Untersuchungen der Cytochrom P450 Enzyme durch zeitabhängige Enzyminduktionsprofile mittels Cocktail-Assay und mRNA-Expression gemessen.
Das CYP2C8 wurde als neues, von Statinen stark induziertes P450 Enzym identifiziert. Es wurde eine bis zu 20-fache Zunahme der Aktivität durch Atorvastatin und eine ~10-fache Zunahme durch Simvastatin- und Lovastatinbehandlung nachgewiesen. Die Enzyme CYP3A4, CYP2B6 und CYP2C9 zeigten geringere, aber auch deutliche Aktivitätssteigerungen durch die Behandlung mit Atorvastatin und Simvastatin (4 bis 11-fach). Lovastatin und Rosuvastatin hatten geringere Effekte.
Die Expression der mRNA entsprach weitestgehend den Beobachtungen der Aktivitäten, wobei jedoch die Auswirkungen dynamischer und drastischer mit wesentlich höheren Induktionsleveln ausfielen.
Die Ergebnisse deuten auf einen stärkeren Einfluss der Behandlung mit Statinen auf P450 Expression und Aktivität hin, als bisher angenommen. Dies könnte besonders für die Co-Medikation mit anderen über CYP2C8 metabolisierten Arzneistoffen von entscheidender Bedeutung sein.
Aufgrund von Korrelationsanalysen der P450 Enzymaktivitäten zu ihrem spezifischen Proteingehalt in humanen Leberproben (Leberbank am IKP) wurden unterschiedliche Ergebnisse hinsichtlich der Funktion einzelner CYP-Enzyme beobachtet. Manche CYP-Enzyme, wie z.B. CYP3A4 mit der Hydroxylierung von Atorvastatin oder CYP1A2 mit der Bildung von Acetaminophen zeigten sehr gute Korrelationen. Andere Enzyme wie z.B. CYP2C9 mit dem spezifischen Substrat Diclofenac, korrelierten wesentlich schlechter.
Diese Unterschiede könnten neben biologischen Faktoren und Umwelteinflüssen mit Variabilität in den Enzymen NADPH:P450 Oxidoreduktase (POR), Cytochrom b5 oder den beiden Progesteronrezeptor-Membrankomponenten PGRMC1 und PGRMC2 zusammenhängen. Denn als potentielle Elektronendonatoren der CYP-Enzyme wären diese maßgeblich am Metabolismus von Xenobiotika beteiligt.
Zur Untersuchung, welchen Einfluss die Elektronendonator-Proteine auf die Aktivität der CYP-Enzyme haben, wurde die Technik einer lentiviral basierten RNA-Interferenz (RNAi) für diese Gene in primären humanen Hepatozyten entwickelt und die P450 Aktivitäten mittels Cocktail-Assay nach dem »Knock-Down« dieser Gene bestimmt.
Für die P450 Reduktase wurde ein erfolgreiches »Gene Silencing« von durchschnittlich 85% auf mRNA-Ebene erzielt. Die Expression von Cytochrom b5 wurde um 51% reduziert, PGRMC1 um ca. 30%. Für PGRMC2 konnte bisher kein signifikanter »Knock-Down« nachgewiesen werden.
Nach dem »Silencing« der Reduktase wurde für die P450 Enzymaktivitäten nach 4 Tagen durchschnittlich ein leichter Rückgang von ca. 10-30% beobachtet. Nach einer Zeitdauer von 7 Tagen wurde für das CYP3A4 im Vergleich zur Kontrolle nur noch eine Restaktivität von ungefähr 5% detektiert.
Für die beiden anderen potentiellen Elektronendonatoren Cytochrom b5 und PGRMC1 wurde entsprechend eine um 85% bzw. 75% reduzierte CYP3A4 Aktivität nachgewiesen.
Diese ersten Ergebnisse sprechen deutlich für eine Interaktion der Enzyme POR, Cytochrom b5 und PGRMC1 mit den Arzneistoff metabolisierenden P450 Enzymen.
The variability of the expression and function of the P450 enzymes (CYPs) is a cause for having different intensities and lengths of effects as well as side effects when patients are given the same dosage of medication. Up to this day, one cannot allover explain this inter individual variability of expression and activity of the enzymes. In general, there are several factors that may affect the variability, including biological factors (such us age, gender, hormonal status), environmental factors (such as nutrition, smoking, medication) as well as genetic factors like polymorphisms
In order to solve this problem and to analyze relatively easy and fast activity differences, we developed an LC-MS/MS based P450 activity cocktail assay to quantify and detect simultaneously the seven most important CYPs as judged by their roles in the metabolism of clinically used drugs. The assay was established for use in in human hepatocytes as well as in recombinant and microsomal enzymes.
We used the newly developed model-substrate cocktail assay to analyze the time-dependent induction of seven drug metabolizing cytochrome P450 activities as response to treatment of primary human hepatocytes with different statins.
The strongest induction was observed for amodiaquine N-desalkylation of CYP2C8, which was induced up to 20-fold by atorvastatin and approximately 10-fold by simvastatin and lovastatin. Enzymes CYP3A4, CYP2B6 and 2C9 showed lower, but also significant induction after treatment with atorvastatin and simvastatin (4-11-fold). lovastatin and rosuvastatin demonstrated minor effects.
Quantitative RT-PCR confirmed corresponding changes on the mRNA level with even more dramatic induction up to almost 100-fold.
These data suggest a broader inducing effect of statins on cytochrome P450 expression and activity than previously known, thus further emphasizing their drug-drug interaction potential, especially for CYP2C8.
Based on correlation analysis with P450 enzyme activity to their specific protein amount in human liver samples (liverbank IKP) were different functional results observed. Enzymes like CYP3A4 with atorvastatin hydroxylation or CYP1A2 with formation of acetaminophen showed very good correlations. Others like i.e. CYP2C9 with specific substrate diclofenac correlated much lower.
Besides biological and environmental factors could these differences based on variability of the enzymes NADPH:P450 oxidoreductase (POR), cytochrome b5 or the two progesterone receptor-membrane components PGRMC1 and PGRMC2. After all, they would take active part in the metabolism of the xenobiotica as possible electron donors of the CYP enzymes.
In order to analyze what kind of influence these proteins have on CYP enzyme activity, we developed a lentiviral based RNA-interference (RNAi) method in human hepatocytes and determined P450 activity with cocktail-assay after knocking down these genes.
For the P450 reductase, we achieved a successful gene silencing of about 85% on mRNA level. The expression of cytochrome b5 was reduced by 51%, PGRMC1 about 30%. So far, it has not been possible to prove a significant knock down of PGRMC2.
After silencing of reductase, an average light decline of about 10-30% of P450 enzyme activities was observed after 4 days. After a period of 7 days, a rest activity of CYP3A4 of only about 5% was detected. For both other potential electron donators cytochrome b5 and PGRMC1 was a reduced activity of 85% and 75% determined.
These first results indicate a clear interaction of the enzymes POR, cytochrome b5 and PGRMC1 with the drug metabolizing enzymes.
1290517618
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/520/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/520/pdf/elektr_Diss.2010_DianaFeidt.pdf
Feidt, Diana M.
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Biologische Chemie und Ernährungswissenschaft
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2010-11-29T08:39:31Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-5081
Untersuchungen zur Biogenese von Proteinen in der mitochondrialen Innenmembran
Studies on the biogenesis of proteins in the mitochondrial inner membrane
Universität Hohenheim
Proteine
ATP
Biogenese
Life sciences
Proteinimport
Assemblierung
mitochondriale Innenmembran
Protein
Assemblz
Mitochondria
ATP Synthases
Mitochondrien und Prokaryonten weisen vielerlei Ähnlichkeiten auf, vermutlich sind sie in der Evolution aus gemeinsamen Vorläufern hervor gegangen. So ist zu erwarten, dass sich ausgeprägte Ähnlichkeiten auch in der Biogenese ihrer Proteine nachweisen lassen. In der vorliegenden Studie wurde dieser Vermutung in Untersuchungen zur Biogenese bestimmter Proteinkomplexe der mitochondrialen Innenmembran nachgegangen. Als Modellorganismus diente dabei die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae.
(1) Die γ-Untereinheit der ATP-Synthasen ist in Mitochondrien und Prokaryonten hoch konserviert. Aus älteren Untersuchungen ist bekannt, dass Deletionen am N- oder C-Terminus der γ-Untereinheit nur eine überraschend geringe Reduktion der enzymatischen Aktivität zur Folge haben. In der Experimenten der vorliegenden Studie wurde nun gefunden, dass N- und C-Terminus der γ-Untereinheit für eine effiziente Assemblierung in der ATP-Synthase in den Mitochondrien der Hefe essentiell sind. Bei einer Deletion von 9 Aminosäuren am N-Terminus oder 10 Aminosäuren am C-Terminus wurde die γ-Untereinheit effizient in die Mitochondrien importiert. Der Anteil der Untereinheit, der dann innerhalb von 10 Min. bei 25°C assembliert wurde, reduzierte sich aber um etwa die Hälfte. Deletionen von mehr als 9 N-terminalen oder mehr als 20 C-terminalen Aminosäuren reduzierten den Anteil der assemblierten Untereinheit um mehr als 90%. Hefe-Stämme, die eine verkürzte γ-Untereinheit synthetisierten, waren auf Glycerin als Kohlenstoffquelle nicht lebensfähig. Vermutlich sind N- und C-Terminus der Untereinheit in den ATP-Synthasen sowohl der Mitochondrien, als auch in der Prokaryonten für die Assemblierung von größerer Bedeutung als für die Energieübertragung.
(2) Die Metabolittranslokatoren der mitochondrialen Innenmembran sind vermutlich erst im Kontext der Evolution der eukaryontischen Zellen entstanden. Gemeinsam ist den Metabolittranslokatoren das Sequenzmotiv P x (D/E) x x (K/R), das als Carrier signature bezeichnet wird. Für ein Mitglied der Proteinfamilie, den Dicarboxylattranslokator, wurde nun gefunden, dass die Carrier signature die Biogenese des Proteins wesentlich erleichtert. Insbesondere wird der Transport des neu synthetisierten Proteins vom Cytosol in den Intermembranraum wesentlich beschleunigt.
(3) Das Protein Oxa1 gehört zu einer Proteinfamilie, zu der auch das Protein YidC der Prokaryonten zählt. Sowohl Oxa1, als auch YidC sind Mediatoren der Proteininsertion in ihren jeweiligen Membranen, und in dieser Funktion u.a. an ihrer eigenen Biogenese beteiligt. Eine Reihe verschiedener Experimente zur Biogenese des mitochondrialen Oxa1 hat nun ergeben, dass neu synthetisiertes Oxa1 nach Import in die Mitochondrien wahrscheinlich nicht vollständig in die mitochondriale Matrix transportiert wird. Vielmehr scheint es im TIM23-Komplex, der Proteintranslokase der Innenmembran, zu akkumulieren und dann unmittelbar in die Lipidphase der Membran zu inserieren. Damit zeigt das Oxa1 eine ähnliche Biogenese wie das bakterielle YidC, das zunächst von der SecYEG-Translokase aufgenommen und dann unmittelbar in die Plasmamembran eingelagert wird. Oxa1 und YidC scheinen somit nicht nur in ihrer Struktur, sondern auch in ihrer Biogenese und in ihrer Funktion signifikante Ähnlichkeiten zu haben.
Insgesamt zeigte sich in den Experimenten der vorliegenden Studie, dass sich mitochondriale und prokaryontische Proteine auch nach mehr als zwei Milliarden Jahren getrennter Evolution selbst in molekularen Details ihrer Funktion noch sehr ähnlich geblieben sind.
Mitochondria and prokaryotes show many similarities and it is a well established notion that they have common ancestors. It is therefore reasonable to expect significant similarities also in the biogenesis of their proteins. This study followed this idea in investigations on the biogenesis of protein complexes in the mitochondrial inner membrane. The yeast Saccharomyces cerevisiae served as a model organism.
(1) The γ-subunit of ATP synthases is highly conserved both in mitochondria and in prokaryotes. Previous studies demonstrated that deletions at the N- or C-terminus of the subunit entail only mild reductions in the enzymatic activity, and the reason of the conserved structure was enigmatic. The experiments of this study show that N- and C-terminus of the γ-subunit are essential for an efficient assembly in the ATP synthase. A deletion of 9 residues at the N-terminus or 10 residues at the C-terminus reduced the ratio of the subunit that assembled within 10 min. at 25°C by about 50%. Deletions of more than 9 N- or more than 20 C-terminal residues reduced the share of the assembled subunit by more than 90%. Yeast strains that synthesized a shortened γ-subunit did not grow on glycerole. N- and C-terminus are probably more relevant for assembly of the ATP synthase than for the transmission of energy. It is proposed that this is the case both for mitochondria and for prokaryotes.
(2) The metabolite carrier proteins of the mitochondrial inner membrane were probably newly developed during the evolution of the eukaryotic cells. A common sequence motif of all carrier proteins is the carrier signature, P x (D/E) x x (K/R). The data of this study show that the carrier signature substantially facilitates the biogenesis of the dicarboxylate carrier (DIC). In particular, the translocation of this protein across the mitochondrial outer membrane is significantly accelerated.
(3) The mitochondrial inner membrane protein Oxa1 is a member of a protein family that includes the bacterial protein YidC. Both Oxa1 and YidC act as mediators of protein insertion in their membranes, and both proteins participate in their own biogenesis. In this study, a series of experiments indicates that newly synthesized Oxa1 is not imported into the mitochondrial matrix, but accumulates in the inner membrane TIM23 translocase, for direct integration into the lipid bilayer. Oxa1 thereby shows a similar principle of membrane insertion as prokaryotic YidC. This was previously shown to first accumulate in the SecYEG translocase and then to directly integrate into the bacterial plasmamembrane. Oxa1 and YidC thus seem to resemble each other both in their structure and in their biogenesis.
In summary, the experiments show that mitochondrial and prokaryotic proteins, after two billion years of separate evolution, have retained surprising similarities, even in molecular details of their function.
1291016371
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/508/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/508/pdf/Diss_Randel_20101019.pdf
Randel, Olga
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Mikrobiologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:522
2011-01-04T11:24:44Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-5220
Neue Messtechniken und Simulationen für die Strömungsvorgänge und den örtlichen Stoffübergang in nicht-Newtonschen Fluiden
New measuring techniques and simulations of flow phenomena and local mass transfer in non-Newtonian fluids
Universität Hohenheim
Konvektion
Stoffübergang
Numerische Strömungssimulation
Rheologie
Spacer
Viskosität
Visualisierung
Life sciences
nicht-Newton'sche Flüssigkeiten
non-Newtonian fluids
Flow and transport phenomena in non-Newtonian fluids are of significant industrial interest. As a kind of static mixer, spacers play an important role in process engineering concerning problems of mixing, homogenizing and dispersing in connection with residence time behavior up to the enhancement of heat and mass transfer. However, the efficiency of such spacers strongly depends on fluid properties, the characteristic geometry and operating conditions. Additionally, it is very difficult to respond to changed operating conditions for such spacers and ill-designed feed spacers can hinder the realization of a high performance.
Here, experimental and numerical methods were introduced for the investigation of flow phenomena and mass transfer for non-Newtonian fluids in spacer-filled channels.
Strömungs- und Transportvorgänge in nicht-Newton?schen Flüssigkeiten sind von besonderem industriellen Interesse. In der Verfahrenstechnik werden Spacer eingesetzt zur Lösung von Problemen beim Mischen, Homogenisieren und Dispergieren, zur Erzielung eines günstigen Verweilzeitverhaltens sowie zur Steigerung des Stoff- und Wärmetransports. Die Effizienz solcher Spacer hängt stark ab von den Fluideigenschaften, von der Spacer-Geometrie und von den Betriebsbedingungen. Deswegen kommt einer Optimierung dieser Spacer für die jeweiligen Randbedingungen eine wesentliche Rolle zu. Die vorliegende Arbeit befasst sich deswegen mit experimentellen und numerischen Methoden zur Untersuchung der Strömungs- und Transportvorgänge in Kanälen mit Spacern für nicht-Newton?sche Flüssigkeiten.
1294136684
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/522/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/522/pdf/Zheng_last_version_korrigierte.pdf
Zheng, Gongyuan
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:523
2011-01-13T11:28:36Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-5232
Identification and functional studies of two novel serine phosphorylation sites of insulin receptor substrate (IRS)-2: Ser 675 and Ser 907
Universität Hohenheim
Insulinrezeptor
Insulin
Insulinresistenz
Insulinstoffwechsel
Phosphorylierung
Protein-Serin-Threonin-Kinasen
Serin
Life sciences
Insulinrezeptorsubstrat
mTOR
ERK1/2
IRS-2
insulin receptor substrate
insulin
phosphorylation
serine
Insulin receptor substrate (IRS) proteins are major transducers of the insulin and IGF-1 signal into the PI-3 kinase/PKB and the MAP kinase pathway. In addition to tyrosine phosphoryla-tion, a large number of serine/threonine phosphorylation sites enable the IRS proteins to inte-grate different extra- and intracellular stimuli resulting in positive and negative modulation of the insulin and IGF-1 signal. Chronic hyperphosphorylation of serine/threonine sites of IRS-1 is involved in the development of insulin resistance. IRS-2 is of great importance for β-cell survival and for the regulation of hepatic metabolism. The study of serine/threonine phos-phorylations is required to understand the physiological and pathophysiological regulation of this important mediator of insulin signaling. In this thesis two novel IRS-2 serine phosphoryla-tion sites have been identified and characterized (mouse amino acid numbering): Ser 675, which is located in the kinase regulatory loop binding (KRLB) domain unique to IRS-2 and Ser 907, which is adjacent to the Grb2 binding site Tyr 911. Using phospho-site specific antibod-ies both sites were demonstrated to be phosphorylated upon insulin, phorbol ester and ani-somycin treatment in Fao rat hepatoma cells. The phosphorylation was also detected in pri-mary human hepatocytes and in liver tissue of insulin treated or refed mice.
The insulin-induced phosphorylation of Ser 907 was mediated by the MAP kinase ERK1/2. Simulation of a permanent phosphorylation of this site in BHK cells expressing IRS-2 Glu 907 led to a slight decrease of IRS-2 tyrosine phosphorylation with no apparent effect on insulin downstream signaling. The insulin-induced association of IRS-2 with Grb2 in HEK293 cells was abrogated by mutation of the adjacent Tyr 911 to Phe, but not influenced by mutation of Ser 907 to Ala. Of note, the activation of MAP kinase signaling was not impaired in HEK293 cells expressing IRS-2 Phe 911 and not regulated by the expression level of IRS-2 wildtype, but completely dependent on IR expression, indicating the importance of an alternative, IRS-2-Grb2-independent pathway for the activation of MAP kinase signaling in these cells.
The insulin-induced phosphorylation of Ser 675 was dependent on mTOR, but not on the downstream kinase p70 S6K1. Prevention of this phosphorylation in BHK cells or HEK293 cells expressing IRS-2 Ala 675 had no effect on proximal or distal insulin signal transduction. But compared with IRS-2 wildtype, the mutated IRS-2 protein Ala 675 showed increased half life in cycloheximide-treated HEK293 cells. Thus, phosphorylation of Ser 675 could have a similar function as its homologous site Ser 632 in IRS-1 and could be involved in the regula-tion of mTOR-dependent IRS-2 proteasom-mediated protein degradation.
Die Insulin Rezeptor Substrate (IRS) sind bedeutende Vermittler des Insulin- und des IGF-1-Signales in den PI-3 Kinase- und den MAP Kinase-Signaltransduktionsweg. Zusätzlich zu Tyrosinphosphorylierungen ermöglichen eine große Anzahl an Serine/Threonin-Phosphorylierungsstellen der IRS-Proteine die Integration von verschiedenen extra- und in-trazellulären Stimuli was zu einer positiven und negativen Modulation des Insulin- und IGF-1 Signales führt. Chronische Hyperphosphorylierungen der Serin/Threonin-Reste des IRS-1 sind an der Entstehung von Insulinresistenz beteiligt. IRS-2 hat eine besondere Bedeutung für das Überleben der β-Zellen sowie für die Regulation des hepatischen Metabolismus. Die Untersuchung der Serin/Threonin-Phosphorylierungen ist die Voraussetzung um die physio-logische und pathophysiologische Regulation dieses wichtigen Vermittlers des Insulinsignales zu verstehen. In dieser Doktorarbeit wurden zwei neue IRS-2 Phosphorylierungsstellen identi-fiziert und charakterisiert (Maus IRS-2 Aminosäure Nummerierung): Ser 675, das in der IRS-2-spezifischen kinase regulatory loop binding (KRLB) Domäne liegt und Ser 907, das in der Nähe eines Grb2-Bindungsmotives (Tyr 911) liegt. Mit phospho-site-spezifischen Antikörpern wurden beide Phosphorylierungen in Fao Ratten Hepatoma-Zellen nach Insulin-, Phorbo-lester- und Anisomycinstimulation nachgewiesen. Die Phosphorylierungen wurden auch in primären humanen Hepatocyten sowie in Lebergewebe von insulinbehandelten oder gefütter-ten Mäusen detektiert.
Die insulininduzierte Phosphorylierung von Ser 907 wurde durch die MAP Kinase ERK1/2 vermittelt. Die Simulation einer permanenten Phosphorylierung dieses Serinrestes in BHK-Zellen, die IRS-2 Glu 907 transient exprimierten, führte zu einer leichten Abnahme der IRS-2-Tyrosinphosphorylierung hatte aber keinen offensichtlichen Einfluss auf die nachgeordneten Insulin-Signaltransduktionskaskaden. Die insulininduzierte Bindung von Grb2 an IRS-2 war in HEK293 Zellen durch Mutation des benachbarten Tyrosin 911 zu Phenylalanin aufgehoben, wurde jedoch durch eine Mutation von Serin 907 zu Alanin nicht beeinflusst. Die Aktivierung des MAP Kinase Signalweges in IRS-2 Phe 911-überexprimierenden HEK293 Zellen war jedoch nicht beeinträchtigt und war auch nicht induziert durch die Überexpression des Wildtyp IRS-2. Allerdings war die Aktivierung dieses Signalweges vollständig abhängig von der Höhe der Insulinrezeptor-Expression, was auf einen alternativen, IRS-2-Grb2-unabhängigen Sig-nalweg bei der Aktivierung der MAP Kinase hindeutet.
Die insulininduzierte Phosphorylierung von Ser 675 war abhängig von mTOR, jedoch nicht von seiner nachgeschalteten Kinase p70 S6K1. Die nicht-phosphorylierbare Ser 675 Ala Mutante, exprimiert in BHK und HEK293 Zellen, hatte keinen Einfluss auf die proximale oder distale Insulin-Signalweiterleitung. Allerdings hatte das mutierte IRS-2 675 Ala Protein eine verlängerte Halbwertszeit in Cycloheximid-behandelten HEK293 Zellen. Die Phosphorylie-rung von Ser 675 könnte daher eine ähnlich Funktion haben wie das homologe Ser 632 im IRS-1 und an der mTOR-abhängigen proteasomalen IRS-2 Proteindegradation beteiligt sein.
1294914516
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/523/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/523/pdf/Diss_Louise_Fritsche.pdf
Fritsche, Louise
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Biologische Chemie und Ernährungswissenschaft
oai:opus.uni-hohenheim.de:574
2011-02-17T16:06:53Z
ddc:570
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Dekontamination von pharmazeutischen Isolatoren mit verdampftem Wasserstoffperoxid : Charakterisierung von Einflussparametern und Optimierung des Maschinendesigns
Decontamination of pharmaceutical isolators with vaporized hydrogen peroxide : characterization of influencing factors and optimization of machine design
Universität Hohenheim
Dekontamination
Wasserstoffperoxid
Bioindikator
Bacillus stearothermophilus
Spore
Kondensation
Life sciences
D-Wert
Pharmazeutischer Isolator
VPHP
Spaltgängigkeit
Mikrobiologische Inaktivierung
D-value
Pharmaceutical isolator
VPHP
gap pentetration
micorbial inactivation
In the pharmaceutical industry sterile drugs, which can not be terminally sterilized, have to be prepared and handled under aseptic conditions. The application of isolator technology with physical separation of the process from the environment and the operator is commonly used. Prior to the aseptic processing, the inner isolator surfaces have to be treated with a sterilant to reduce the microbial contamination to a defined acceptable level. Today vaporized hydrogen peroxide (VPHP) is most commonly used for this purpose. Different parameters like hydrogen peroxide concentration, humidity, and condensation have an influence onto the microbicidal activity of the decontamination cycle. Also isolator design factors (e.g. material of construction, geometrical structure) can impact the inactivation results. The objective of the presented thesis was to investigate the mode of action of the VPHP and the relationship between different influencing cycle parameters in order to develop a recommendation for optimum decontamination conditions. An additional goal was to analyze the impact of different construction materials, surface finish and geometrical structures onto the inactivation efficiency of the sterilant to improve the design of aseptic processing machines regarding VPHP decontamination.
For the studies an pharmaceutical isolator connected to a VPHP generator was used. Standard decontamination cycles with varying combinations of hydrogen peroxide and water concentration, cycle time and condensation levels were developed. Biological indicators (BIs) with defined initial spore population of Geobacillus stearothermophilus were exposed to the different VPHP cycles. By determination of inactivation kinetics for the microbial test challenge, the sporicidal activity for each set of cycle conditions was evaluated. The applied microbial methods were Most Probable Number (MPN) technique as well as the determination of decimal reduction times (D-values). BIs were not only tested when openly exposed to the sterilizing atmosphere, but also inside of defined gaps to challenge the penetration capability of the VPHP into small lumens under diffusive conditions. Different construction materials were inoculated with defined spore populations to investigate the resistance behaviour of the spores on varying surfaces. Supplementary the physico-chemical characteristics of the respective materials were analyzed in detail to draw conclusions regarding correlation of surface quality and inactivation properties.
The results demonstrate that the decisive factor for a successful decontamination is the overall microscopic interaction with the bioburden on the surface. It is shown, that the microcondensation in the sub-visible range is effective for good inactivation performance and that further condensation in the visible range does not enhance the microbicidal activity. The data illustrate that the microbial inactivation is accelerated by increasing hydrogen peroxide concentration. An H2O2 level of 800 ppm ensures a sufficient deposition of sterilant onto the surface and results in excellent and reproducible kill. For sterilant levels > 800 ppm no further improvement in inactivation is detectable. It is shown that for openly exposed BIs a lower H2O2 level (400 ppm) can be compensated by higher humidity. The elevated water content in the decontamination atmosphere promotes the sterilant deposition. The higher the hydrogen peroxide level is, the more independent from humidity becomes the inactivation effect. For H2O2 levels of 800 ppm, the microbicidal activity of the VPHP is found to be independent from the water concentration.
In contrast to the openly exposed BIs, for the inactivation of spores exposed under diffusive conditions inside of gaps, a lower hydrogen peroxide level can not be compensated by higher humidity. Solely the hydrogen peroxide concentration and the overall cycle duration are able to influence the decontamination success inside of the trenches. It is demonstrated that in principle complex structures can be decontaminated by the means of VPHP but the penetration capability is limited. The inactivation is impeded with decreasing gap cross section and with increasing gap depth. It is shown that different construction materials and surface textures have an impact onto the resistance behaviour of spores towards VPHP.
In der pharmazeutischen Industrie müssen sterile Medikamente, die nicht terminal sterilisierbar sind, unter aseptischen Bedingungen gefertigt werden. Hierfür können Isolatorsysteme, die den Verarbeitungsprozess mittels physikalischer Barrieren von der Umgebung und dem Bediener trennen, verwendet werden. Bevor ein aseptischer Prozess durchgeführt werden kann, müssen die inneren Oberflächen des Isolators mit einem Sterilisationsmittel behandelt werden, um die mikrobielle Kontamination auf ein definiertes akzeptables Niveau zu reduzieren. Für diesen Zweck wird am häufigsten verdampftes Wasserstoffperoxid verwendet (Vaporized Hydrogen Peroxide, VPHP). Unterschiedliche Zyklusparameter wie die H2O2-Konzentration, Feuchtigkeit und Kondensation haben einen Einfuss auf die mikrobizide Aktivität des Dekontaminationszyklus. Darüber hinaus beeinflussen auch Designfaktoren des Isolators (z.B. Konstruktionsmaterial, geometrischer Aufbau) die Inaktivierungsergebnisse.
Die Zielsetzung der vorliegenden Dissertation war es, den Wirkmechanismus des VPHP zu untersuchen, um eine Empfehlung für optimale Dekontaminationsbedingungen zu entwickeln. Darüber hinaus sollte der Einfluss von unterschiedlichen Konstruktionsmaterialien und Oberflächengüten sowie von geometrischen Strukturen auf die Inaktivierungsleistung des VPHP hin zu untersuchen.
Für die Untersuchungen wurde ein pharmazeutischer Isolator mit VPHP-Generator verwendet. Es wurden standardisierte Dekontaminationszyklen mit verschiedenen Peroxid- und Wasserkonzentrationen sowie Zykluszeiten entwickelt. Bioindikatoren (BIs) mit definierten Ausgangspopulationen von Geobacillus stearothermophilus Sporen wurden während der verschiedenen Dekontaminationszyklen exponiert. Über die Bestimmung von Inaktivierungskinetiken für die Test-Mikroorganismen konnte die sporizide Wirksamkeit jeder Kombination von Zyklusbedingungen ermittelt werden. Die verwendeten mikrobiologischen Methoden waren die ?Most Probable Number? MPN- sowie die D-Wert-Bestimmung. Die BIs wurden im Isolator nicht nur offen exponiert getestet, sondern auch exponiert innerhalb von Spalten. Dabei sollte das Eindringverhalten des VPHP in kleine Öffnungen untersucht werden. Verschiedene Konstruktionsmaterialien wurden mit definierten Ausgangspopulationen von Sporen beimpft, um das Resistenzverhalten der Mikroorganismen auf unterschiedlichen Oberflächen zu prüfen. Zusätzlich wurden die physikalisch-chemischen Eigenschaften der jeweiligen Materialien untersucht, um Rückschlüsse auf eine Korrelation von Oberflächencharakteristika und dem Resistenzverhalten der Sporen zu ermitteln.
Die Ergebnisse zeigen, dass mehrere Zyklusparameter die sporizide Aktivität des VPHP beeinflussen. Der entscheidende Faktor für eine erfolgreiche Dekontamination ist die mikroskopische Wechselwirkung des Sterilisationsmittels mit den Keimen auf der Oberfläche. Es wird aufgezeigt, dass die Mikrokondensation im nicht-sichtbaren Bereich entscheidend ist für eine zufriedenstellende Inaktivierungsleistung und dass darüber hinausgehende Kondensation im sichtbaren Bereich keine weitere Verbesserung der mikrobiziden Aktivität mit sich bringt. Die Daten veranschaulichen, dass die mikrobielle Inaktivierung mit steigender Wasserstoffperoxidkonzentration beschleunigt wird. Eine H2O2-Konzentration von 800 ppm stellt eine ausreichende Deposition von Sterilisationsmittel auf den Oberflächen sicher und resultiert in exzellenter und reproduzierbarer Abtötung. Für Konzentrationen > 800 ppm, kann keine weitere Verbesserung der Inaktivierung beobachtet werden. Es wird gezeigt, dass für offen exponierte Bioindikatoren eine niedrigere H2O2-Konzentration (400 ppm) durch einen höheren Feuchtigkeitslevel ausgeglichen werden kann. Der erhöhte Wassergehalt in der Dekontaminations-Atmosphäre begünstigt den Niederschlag des Dekontaminationsmittels. Je höher die H2O2-Konzentration ist, desto unabhängiger wird der Inaktivierungserfolg vom Feuchtigkeitsgehalt der Atmosphäre. Für H2O2-Konzentrationen von 800 ppm ist die mikrobizide Wirksamkeit unabhängig von der Wasserkonzentration.
Bei Indikatoren, die innerhalb von Spalten exponiert sind, kann eine mangelnde H2O2-Konzentration nicht durch eine höhere Feuchtigkeit kompensiert werden. Innerhalb der Spalten können ausschließlich die Höhe der H2O2-Konzentration sowie die Dauer des Zyklus den Dekontaminationserfolg beeinflussen. Es wird gezeigt, dass auch komplexe Strukturen mit VPHP dekontaminiert werden können, das Eindringverhalten jedoch limitiert ist. Mit sinkendem Spaltquerschnitt und mit zunehmender Tiefe der Spalten wird die Inaktivierung zunehmend erschwert. Es werden Materialien mit guter und schlechter Dekontaminationscharakteristik identifiziert und Ursachen für das ungleiche Verhalten ermittelt.
1297955213
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/574/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/574/pdf/Dissertation_BUngerBimczok.pdf
Unger-Bimczok, Beatriz
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:573
2011-03-03T08:05:37Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-5731
Charakterisierung von Interaktionspartnern des Kernrezeptors CAR (?Constitutive Androstane Receptor?) mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie
Characterization of interaction partners of the nuclear receptor CAR (constitutive androstane receptor) by MALDI-TOF mass spectrometry
Universität Hohenheim
konstitutiver Androstanrezeptor
Kernrezeptor, MALDI-MS
Life sciences
SMARCC1
SWI/SNF Chromatin-remodling Komplex
constitutive androstane receptor
nuclear receptor
Der konstititutive Androstanrezeptor (constitutive androstane receptor; CAR; NR1I3), ein Kernrezeptor, spielt eine entscheidende Rolle in der Induktion des Arzneimittelmetabolismus und -transports durch Aktivatoren vom Phenobarbital-Typ. Die hepatische Expression zahlreicher arzneimittelmetabolisiernder Enzyme der Phase I und Phase II sowie von Transportproteinen wird durch CAR als Antwort auf diverse Chemikalien induziert. Neben seiner Funktion in der Entgiftung von Fremdstoffen ist CAR auch involviert in andere hepatische Funktionen wie Fettsäureoxidation, Glukoneogenese und die Sekretion von Steroidhormonen und Bilirubin. In primären Hepatozyten ist CAR vorwiegend im Cytoplasma lokalisiert und mit anderen Proteinen in einem großen Multimerkomplex assoziiert, dessen Komponenten noch nicht vollständig identifiziert wurden. Durch Aktivatoren wie Phenobarbital dissoziiert CAR von bekannten Proteinen des Multimerkomplexes, dem cytosolischen CAR-Retentionsprotein (CCRP) und dem Chaperon HSP90. Dies führt nach Dephosphorylierung durch die Proteinphosphatase 2A (PP2A) zur Translokation in den Nukleus, wo CAR mit dem Retinoid-X-Rezeptor (RXR) heterodimerisiert. CAR-RXR bindet an die entsprechenden DNA-Bindungsstellen in der regulatorischen Region der Zielgene und rekrutiert Ko-Aktivatoren wie SRC-1 (Steroidrezeptor Ko-Aktivator), GRIP1 (Glutamatrezeptor interagierendes Protein) und PGC-1 (Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor γ Ko-Aktivator 1), um die Gentranskription zu induzieren.
Ziel dieser Arbeit war es, den in der Leber exprimierten Kernrezeptor CAR auf putative Interaktionspartner zu untersuchen, um eventuell Hinweise auf Aufbau und Regulation des nativen Proteinmultimerkomplexes zu erhalten und um die Funktion von CAR besser verstehen zu können.
Zu diesem Zweck wurde ein in vitro Pulldown-Assay mit Leberhomogenat zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen von CAR etabliert. Als ersten Schritt wurden GST und GST-CAR-LBD-Fusionsproteine generiert, die in E. coli Bakterienzellen exprimiert und anschließend affinitätsgereinigt wurden. Die Fusionsproteine wurden mit Leberhomogenat inkubiert und gebundene Proteine mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Nach Visualisierung mit Silbernitrat wurden die Proteinbanden ausgeschnitten und für die Massenspektrometrie präpariert. Neue Interaktionspartner von CAR wurden über die massenspektrometrische MALDI (Matrix assisted Laser Desorption/Ionisation)-Methode identifiziert.
Nach Optimierung der Pulldown-Methode wurden diverse Strukturproteine, Transportproteine und Enzyme signifikant als putative neue Interaktionspartner von CAR identifiziert, u.a. das Hitzeschockprotein 70, die Pyruvatcarboxylase, GAPDH, Carbonylreduktase, Lamin A, Phosphatidylinositol Transferprotein 1 und BAF 155 (BRG1-assoziierter Faktor).
Als besonders interessanter potenzieller Interaktionspartner von CAR wurde das Protein BAF 155 im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht. Dieses Protein ist Bestandteil eines Säuger-SWI / SNF Chromatin-?remodeling? Komplexes, der in fundamentalen zellulären Prozessen wie Transkription, Replikation und Reparatur von Chromatin eine wichtige Rolle spielt. Die Interaktion des GST-CAR Fusionsproteins mit BAF 155 wurde mit verschiedenen Methoden wie in vitro GST-Pulldown-Assay und in vivo Immunpräzipitation bestätigt. Im Western Blot wurde BAF 155 in den Pulldown-Proben mit Leberhomogenat ebenfalls nachgewiesen. Eine funktionelle Analyse der Interaktion mittels RNA-Interferenz war leider nicht erfolgreich, da die Methode aus Zeitgründen nicht mehr erfolgreich optimiert und validiert werden konnte. Zusammenfassend konnte der Pulldown-Assay, kombiniert mit massenspektrometrischen MALDI-TOF Analysen, als eine reproduzierbare Methode zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen etabliert werden und lieferte diverse neue putative Interaktionspartner von CAR. Das in dieser Arbeit identifizierte Protein BAF 155 bzw. der ganze SWI / SNF Komplex könnten eine wichtige Rolle in der CAR-induzierten transkriptionalen Aktivierung spielen.
The human nuclear receptor ?constitutive androstane receptor? (CAR; NR1I3) plays a pivotal role in the induction of drug metabolism and transport by phenobarbital-type inducers. The hepatic expression of phase I and phase II drug metabolizing enzymes and of transporters is activated by CAR in response to structurally diverse chemicals. In addition to xenobiotic detoxification, activation of CAR is also involved in other hepatic functions like fatty acid oxidation, gluconeogenesis, clearance of steroid hormones and bilirubin. In primary hepatocytes, CAR resides predominantly in the cytoplasm associated with other proteins in a multimeric complex of which some components still remain to be identified. Upon exposure to inducers CAR dissociates from the already identified proteins of the complex, the cytosolic CAR retention protein (CCRP) and HSP 90 resulting in its translocation into the nucleus, where it heterodimerizes with the retinoid X receptor (RXR). The CAR-RXR heterodimer binds to its respective response elements in the regulatory region of target genes and recruits coactivators like SRC-1 (steroide receptor co-aktivator), GRIP1 (glutamate receptor interacting protein) and PGC 1 (peroxysom-proliferator-aktivated receptor γ co-activator 1) to induce gene transcription. To better understand the function of CAR, this study was focused on the identification of proteins which associate with CAR.
The aim of this work was to identify putative interaction partners of the nuclear receptor CAR which are expressed in liver to get additional information on structure and regulation of the native protein multimer complex und to obtain a better understanding of the functionality of CAR.
Hence, we have established an in vitro pulldown assay with liver homogenate to analyze protein-protein interactions of CAR. As a first step we generated GST and GST-CAR fusion proteins which were expressed in E. coli followed by affinity purification. Then we incubated the fusion proteins with total liver homogenate and separated bound proteins with SDS-PAGE. After visualization with silver staining, the protein bands were excised and prepared for mass spectrometry. For identification of new interaction partners of CAR in liver, the Matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF) was used.
After optimization of the pulldown assay we could identify several proteins like cytoskeletal proteins (e.g. lamin A), enzymes (e.g. pyruvate carboxylase, GAPDH) and chaperones (e.g. HSP 70) as binding to CAR.
As an especially interesting interaction partner of CAR we decided to further investigate the interaction of CAR with BRG1-associated factor (BAF) 155. This protein is a component of the mammalian SWI / SNF chromatin remodeling complex that plays an important role in fundamental cellular processes such as transcription, replication, and the repair of chromatin. Interaction of GST-CAR-LBD fusion protein was confirmed by additional methods like pulldown assay of GST-CAR with (35S)-methionine labeled BAF 155 in vitro and co-immunoprecipitation of the two proteins. Additionally, we could confirm BAF 155 interaction with CAR by Western blotting of the original pulldown samples. Analyzing the interaction of CAR and BAF 155 with RNA interference was not successful, since the method could not be optimized and validated appropriately, due to time constraints.
In conclusion, we were able to establish a highly reliable and reproducible assay to investigate protein interactions resulting in the significant identification of new interaction partners of CAR. Regarding the identified CAR interaction partner BAF 155, this protein or the complete SWI / SNF complex could play a functional role in CAR-mediated transcriptional activation, however further research is needed to establish the role of BAF 155 in CAR function.
1299135937
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/573/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/573/pdf/Dissertation_ClintMelgar.pdf
Melgar, Clint
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Biologische Chemie und Ernährungswissenschaft
oai:opus.uni-hohenheim.de:583
2011-03-16T11:15:14Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-5832
Molekulargenetische Untersuchungen zur Expression des Typ III Effektors NleA 4795 von Shiga Toxin-produzierenden Escherichia coli
Molecular genetic examinations of the expression of type III effector NleA 4795 in Shiga toxin-producing Escherichia coli
Universität Hohenheim
STEC
Virulenzfaktor
Genregulation
EHEC
Life sciences
nicht-LEE kodierter Effektor
NleA, Locus of Enterocyte Effacement
Typ III Sekretionssystem
non-LEE encoded effector
NleA, locus of enterocyte effacement
type III secretion system
Shiga Toxin-produzierende E. coli (STEC) gelten weltweit als wichtige Erreger von lebensmittelbedingten Infektionen und können zu schweren Erkrankungen wie der hämorrhagischen Colitis und dem lebensbedrohlichen hämolytisch-urämischen Syndrom führen. Die Bakterien kolonisieren den Dickdarm des Menschen, wo sie in der Regel zur Ausbildung von charakteristischen ?Attaching und Effacing?-Läsionen führen. Verantwortlich dafür ist eine Pathogenitätsinsel, bezeichnet als ?Locus of Enterocyte Effacement? (LEE), sowie die darauf kodierten Komponenten eines Typ III Sekretionssystems, über das die Bakterien Effektorproteine direkt in die Wirtszellen injizieren können. Zusätzlich zu den LEE-kodierten Effektoren existiert eine große Anzahl an Effektorproteinen, deren kodierende Sequenzen außerhalb der Pathogenitätsinsel lokalisiert sind. Darunter auch der ?Non-LEE encoded Effector A? (NleA), der im Genom von kryptischen oder induzierbaren Prophagen kodiert ist und unter den pathogenen E. coli Stämmen weitverbreitet vorkommt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression und Regulation der nleA-Variante nleA4795 des E. coli O84:H4 Stammes 4795/97 untersucht, welche auf dem Shiga Toxin-konvertierenden Phagen BP-4795 lokalisiert ist. Dabei wurde mit Hilfe eines Luciferase-Reportersystems und der quantitativen Real-Time PCR der Einfluss von verschiedenen Umweltreizen getestet sowie die Abhängigkeit der nleA4795-Expression von bestimmten Regulatorproteinen untersucht. Unter den analysierten Umweltbedingungen kristallisierten sich bestimmte NaCl- und KCl-Konzentrationen als induzierend für die Expression von nleA4795 heraus und lassen daher auf eine osmotisch bedingte Aktivierung schließen. Eine zunächst vermutete Induktion der nleA4795-Expression durch Quorum Sensing in vorkonditioniertem Medium konnte nicht nachgewiesen werden, da keiner der bislang bekannten Autoinducer einen positiven Einfluss ausübte. Die erhöhte Expression von nleA4795 konnte nachfolgend mit einem reduzierten Nährstoffgehalt assoziiert und somit eine Korrelation zwischen der nleA4795-Expression und bakteriellen Stressantwort-Systemen hergestellt werden. Des Weiteren wurde untersucht, ob ein Zusammenhang zwischen der nleA4795-Expression und der Induktion des Phagen BP-4795 sowie der damit verbundenen Expression von Shiga Toxin besteht. Durch Induktionsexperimente mit Norfloxacin konnte jedoch im Gegensatz zur Expression von Shiga Toxin keine Aktivierung, sondern eine starke Repression der nleA4795-Expression nachgewiesen werden.
Die Untersuchungen auf regulatorischer Ebene zeigten die Abhängigkeit der nleA4795-Expression von den drei LEE-kodierten Regulatoren Ler, GrlA und GrlR sowie von den außerhalb des LEE kodierten Pch-Regulatoren. Für den ebenfalls außerhalb der Pathogenitätsinsel kodierten Regulator EtrA konnte kein Einfluss auf die Expression von nleA4795 nachgewiesen werden. Zudem wurden die Regulatorproteine Ler, GrlA und PchA mit Hilfe von Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) auf eine direkte Bindung an die nleA4795-Promotorregion untersucht. Die beiden Regulatoren GrlA und PchA zeigten jedoch keine spezifische Bindung und wurden demzufolge als indirekte Regulatoren der nleA4795-Expression einstuft. Für den Regulator Ler konnte hingegen eine direkte Bindung an bestimmte Bereiche der nleA4795-Promotorregion nachgewiesen und somit eine Integration von nleA4795 in den Ler-vermittelten Regulationskreis des LEE bestätigt werden.
Shiga toxin-producing E. coli (STEC) are the causative agents of foodborne infections in many countries and can lead to severe diseases like hemorrhagic colitis or the life-threatening hemolytic uremic syndrome. The bacteria colonize the human intestine where they normally cause the formation of characteristic ?attaching and effacing?-lesions. Essential for this effect is a pathogenicity island, termed as ?locus of enterocyte effacement? (LEE), that encodes the components of a type III secretion system and several effector proteins, which are translocated directly into the host cells by the TTSS machinery. In addition to the LEE-encoded effectors a large number of effector proteins have been identified which are encoded outside of the pathogenicity island. Among these is the ?non-LEE encoded effector A? (NleA), which is encoded on cryptic or inducible prophages and is widely distributed among pathogenic E. coli strains.
In the present study, the expression and regulation of the nleA-variant nleA4795 of E. coli O84:H4 strain 4795/97 was investigated, which is located on the Shiga toxin-converting bacteriophage BP-4795. Therefore, different environmental conditions as well as certain regulatorproteins were tested on their influence on nleA4795-expression using a luciferase-reportersystem and the quantitative real-time PCR. Among the analyzed environmental factors, certain concentrations of NaCl and KCl were identified to activate nleA4795-expression, indicating an osmotic-based influence. The suggested induction of nleA4795 in preconditioned medium due to quorum sensing could not be confirmed, since none of the so far known autoinducers showed a positive influence on the expression. The increased expression of nleA4795 could be associated with a reduced amount of nutrients in subsequent investigations and therefore demonstrated a relation between nleA4795-expression and bacterial stress-response-systems. Furthermore, a possible correlation of nleA4795-expression with the induction of phage BP 4795 and Shiga toxin-expression was analyzed. Different from the expression of Shiga toxin, induction-experiments with norfloxacin showed no activation, but a strong repression of nleA4795-expression.
Analysis of the regulatory level demonstrated that the expression of nleA4795 depends on the three LEE-encoded regulators Ler, GrlA und GrlR as well as on the Pch-regulators, which are encoded outside of the LEE. The non-LEE encoded regulator EtrA showed no influence on the expression of nleA4795. In addition, the regulator proteins Ler, GrlA and PchA were tested for direct binding to the nleA4795-promoterregion. Regulators GrlA and PchA showed no specific binding and were therefore classified as indirect regulators of nleA4795-expression. In contrast, regulator Ler showed a specific binding to different areas of the nleA4795-promoter region and thereby confirmed the integration of nleA4795 in the Ler-mediated circuit of LEE-regulation.
1300270514
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/583/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/583/pdf/Dissertation_Maike_Schwidder.pdf
Schwidder, Maike
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:592
2011-04-12T10:28:48Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-5923
Development of assessment tools for Lake Sevan (Armenia) by the application of remote sensing data and geographic information systems (GIS) techniques
Universität Hohenheim
Fernerkundung
Geoinformationssystem
Litoral
Life sciences
Sevansee
Landschaftsmaße
Habitateignungsmodell
Lake Sevan
littoral
landscape metrics
habitat suitability models
Lake Sevan is the biggest source of water in Armenia. Its littoral zone, in addition to being a food source and a substrate for macrophytes, algae and invertebrates, provide refuge and spawning habitats for both young & old organisms especially fishes. Between 1933 and 1960s, the lake level had been lowered by 20 m below the original level by increasing the lake outflow intermittently for irrigation and electricity generation. This evidently had ecological and economical consequences on the lake ecosystem.
The importance of assessing the accuracy of spatial data classifications derived from remote sensing methods and used in geographic information system (GIS) analyses has been regarded as a critical component of many projects. In this project, supervised classified QuickBird satellite imageries of both submersed macrophytes and landcover types (emersed vegetation) of the Gavaraget, Tsovazard and Masrik Regions of the study area were validated in a GIS environment. The results of these assessments were represented by error matrices presenting the overall accuracy, the user and producer accuracies in each category, as well as the kappa coefficients.
For submersed macrophytes at the vegetation level, the overall accuracy ranging between 77-88% was achieved in all the investigation years. Alga blooms in the different years impacted on the accuracy of the classification. However, even through severe algal blooms user accuracies between 55% and 95% were achieved. On the other hand, at the growth type level, the overall accuracy was as high as over 70% and as low as below 49%.
For emersed vegetation types, predominantly high overall accuracies of more than 70% were obtained in 2 of the investigation years. Above all, in 2008, only slight overall accuracy could be obtained. For reeds areas, high user accuracies of more than 78% could be obtained, while for shrubs, trees, no vegetation and grasses in the different years, very different classification accuracies were attained.
Two habitat suitability models (one for fishes and one for birds) were built in a GIS environment in this project. While the Crucian Carp (Carassius auratus Gibelio Bloch) was chosen as lead species for the fish habitat, the Common Coot (Fulica atra) and the Great Crested Grebe (Podiceps cristatus) were chosen for the bird habitat models based on expert knowledge on Lake Sevan.
Five fish habitat suitability classes were assigned in the model. There was a similar trend in the fish habitat areas in all the landscapes in Gavaraget, Tsovazard and Masrik regions. The habitat areas increased in 2007 and decreased in 2008. The increases in all the regions were the same (around 43%) while the highest reduction occurred in Gavaraget (47%) followed by Masrik (38%) and Tsovazard (25%) respectively. Apart from the reductions in habitat areas in 2008, there were severe decreases in the quality of the habitat areas in all the regions of interests. The increases and decreases were as a result of interannual fluctuations due to water level fluctuations and algal blooms of Lake Sevan.
Also, for the bird habitat model, five classes were assigned. Tsovazard and Masrik had a similar trend in habitat areas with an initial increase in 2007 followed by a decrease in 2008. However, Gavaraget had reductions in 2007 and 2008. Again, in addition to the severe reductions in the habitat areas in 2008, there were severe decreases in the quality of the habitat areas in all the regions of interests. The changes in emersed macrophyte vegetations and the lake water level fluctuations effected the different changes in the bird habitat areas.
Der Sevansee stellt die größte Süßwasserressource Armeniens. Seine Litoralzone bietet neben Nahrungsressourcen und Substraten für Algen und Invertebraten auch Schutz- und Laichgebiete für juvenile und adulte Tierarten vor allem Fische. Zwischen 1933 und 1960 wurde der Seespiegel zur Bewässerung und Energiegewinnung um fast 20 m abgesenkt, mit drastischen Konsequenzen für das gesamte Seeökosystem.
Die Validierung der Klassifikationsgüte ist ein zentraler Bestandteil in Fernerkundungsprojekten. Innerhalb des vorliegenden Projektes wurden mittels überwachter Klassifikation von Quickbird Satellitenbildern ermittelte Bedeckungen von submersen und emersen Vegetationsstrukturen in den Untersuchungsgebieten Gavaraget, Tsovazard und Masrik der Litoralzone des Sevansees in einer GIS-Umgebung validiert. Die Ergebnisse wruden in einer Fehlermatrix präsentiert, welche Werte zur Gesamtgenauigkeit sowie zur Nutzer- und Erzeugergenauigkeit sowie Kappa-Koeffizienten zur Beurteilung der Zufallswahrscheinlichkeit des Ergebnisses beinhaltet.
Die für submerse Makrophyten für die verschiedenen Untersuchungsjahre ermittelten Gesamtgenauigkeit liegen mit 77-88% auf einem hohen Güteniveau. Algenblüten führten in einzelnen Jahren in bestimmten Gebieten zu Beeinträchtigungen der Klassifikationsgüte. Noch stärker durch Algenblüten beeinträchtigt wurde die Klassifikationsgüte in einzelnen Jahren auf dem Niveau der Wuchstypen, wo die Gesamtgenauigkeiten zwischen 55% und 95% lagen. Auf Artniveau wurden hingegen teilweise recht hohe Gesamtgenauigkeiten von über 70% erzielt, aber auch niedrige von unter 49%.
Für emerse Vegetationstypen wurden ebenfalls überwiegend hohe Gesamtgenauigkeiten von über 70% erzielt, wobei in den 2 Untersuchungsjahren die Werte allerdings stark schwanken. Vor allem im Jahr 2008 konnten in den meisten Untersuchungsgebieten nur geringe Gesamtgenauigkeiten erzielt werden. Vor allem für Schilfbestände Flächen konnten hohe Nutzergenauigkeiten von über 78% erzielt werden, während für Büsche, Bäume, unbewachsene Flächen und Grasland in den verschiedenen Jahren sehr unterschiedliche Klassifikationsgüten erreicht wurden.
Habitatmodelle ermöglichen die Beurteilung der Habitateignung für eine bestimmte Tierart innerhalb eines Untersuchungsgebietes. Zwei Habitatmodelle, eines für Fische und eines für Wasservögel, wurden innerhalb des Projektes in einer GIS Umgebung entwickelt. Während die Karausche (Carassius auratus Gibelio Bloch) als Leitart für Fischhabitate gewählt wurde, wurden die Bläßralle (Fulica atra) und der Haubentaucher (Podiceps cristatus) für die Vogelhabitatmodelle gewählt, basierend auf Expertenwissen lokaler Experten am Sevansee.
Für die Beurteilung der Flachwasserzone als Fischhabitat wurden innerhalb des Modells 5 Eignungsklassen berechnet. In allen Untersuchungsgebieten ergab sich über die Untersuchungsjahre ein ähnlicher Trend. Die Habitatflächen stiegen von 2006 nach 2007 stark an und reduzierten sich wieder nach 2008. Während die Habitatzuwächse 2007 in allen Untersuchungsgebieten in etwa gleich bei ca. 43% lagen, waren die Verluste jeweils recht unterschiedlich, in Gavaraget bei 47%, in Masrik bei 38% und in Tsovasard bei 25%. Unabhängig von den Flächenverlusten der Habitate nahm auch die Habitatqualität stark ab.
Die Schwankungen können sowohl auf den Rückgang der Makrophyten, als auch auf den Anstieg des Wasserspiegels zurückgeführt werden.
Auch für die Vogelhabitatmodelle wurden fünf Eignungsklassen gebildet. Für die Untersuchungsgebiete Tsovasard und Masrik ergaben sich zeitlich ähnliche Trends mit Habitatflächenzunahmen zwischen 2006 und 2007 und Abnahmen zwischen 2007 und 2008, wobei die Ausmaße in beiden Untersuchungsgebieten sehr unterschiedlich waren. In Gavaraget ergab sich jedoch eine stetiger Abnahme der Habitatflächen über die Untersuchungsjahre. Wie auch bei den Fischhabitaten ergab sich für 2008 auch eine starke Abnahme der Habitatqualität.
Da die ökonomische Bedeutung der Karausche für den Sevansee sehr hoch ist, leistet die GIS basierte Habitateignungsanalyse eine wichtigen Beitrag zur Entscheidungsunterstützung bei Maßnahmenplanungen und Erfolgskontrolle. Zusätzlich kann die Karausche auch als Indikator für die ökologische Funktionsfähigkeit der submersen Makrophytenstrukturen dienen. Auch die in allen Untersuchungsgebieten vorkommenden Bläßrallen und Haubentaucher können als Leitarten für die Funktionsfähigkeit der emersen Vegetationsstrukturen dienen.
1302595457
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/592/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/592/pdf/Diss_Thomas_Kwaku_Agyemang_2011.pdf
Agyemang, Thomas Kwaku
Universität Hohenheim, Fakultät Agrarwissenschaften. Institut für Landschafts- und Pflanzenökologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:594
2011-05-05T12:24:26Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-5943
Funktionen N- und C-terminaler Proteindomänen für Assemblierung, subzelluläre Lokalisation und Physiologie der TRP-Ionenkanäle in Drosophila Photorezeptoren
Functions of N- and C-terminal protein domains for assembly, subcellular localization and physiology of TRP ion channels in Drosophila photoreceptors
Universität Hohenheim
Drosophila
Life sciences
eGFP
Phototransduktion
TRP-Ionenkanäle
Sehprozess
Drosophila
eGFP
phototransduction
TRP ion channels
vision
In den Photorezeptorzellen von Drosophila melanogaster sind die Kationen-Kanäle TRP und TRPL für die Erzeugung des Rezeptorpotentials verantwortlich. Es ist bekannt, dass der TRPL-Ionenkanal lichtabhängig seine subzelluläre Lokalisation verändert, während TRP so-wohl in dunkel- als auch in hell-adaptierten Augen im Rhabdomer lokalisiert ist. Des Weiteren gilt als gesichert, dass diese Ionenkanäle als Tetramere vorliegen. In der wissenschaftlichen Literatur wird jedoch kontrovers diskutiert, ob TRP und TRPL nur als Homomultimere oder auch als Heteromultimere auftreten.
In der vorliegenden Arbeit wurde mittels Co-Immunopräzipitationen (Co-IPs) von unmarkierten TRP- oder TRPL-Kanälen gezeigt, dass die tetrameren Kanäle in den Photore-zeptoren von Drosophila ausschließlich aus Homomultimeren bestehen. Co-IPs von eGFP-markierten TRP- oder TRPL-Kanälen zeigten, dass sich die Tetramere aus eGFP-markierten und den entsprechenden endogenen Kanaluntereinheiten zusammensetzen.
Um die biochemischen und physiologischen Eigenschaften der cytosolischen N- und C-Termini von TRP und TRPL untersuchen zu können, wurden im Rahmen dieser Arbeit eGFP-markierte chimäre TRP/TRPL-Ionenkanäle konstruiert und in den Photorezeptorzellen R1-R6 von Drosophila exprimiert. Speziell wurde die Auswirkung dieser Termini auf die Translokation der Ionenkanäle zwischen Rhabdomer und Zellkörper sowie auf die Assemb-lierung der Tetramere untersucht.
Untersuchungen zur Translokation eGFP-markierter Chimären zeigten, dass die Chimäre mit den TRP-Transmembranbereichen und TRPL N- sowie C-Termini eine TRPL-typische, je-doch zeitlich schnellere, Translokation durchführt. Der Austausch von einem der beiden TRPL-Termini gegen TRP bewirkte, dass die Chimären vorwiegend im Zellkörper lokalisiert waren. Diese Lokalisation entspricht weder der Translokation von TRPL noch der rhabdomerischen Lokalisation von TRP. Sequenzmotive, die die subzelluläre Lokalisation der Drosophila TRP-Kanäle bestimmen, sind daher offenbar sowohl im N- als auch im C-Terminus von TRPL lokalisiert und nur im Zusammenspiel beider Termini wirksam.
Co-IPs dieser eGFP-markierten Chimären zeigten, dass für eine Interaktion mit dem TRPL-Kanal der C-Terminus von TRPL wichtiger zu sein scheint als der N-Terminus. Für die Inter-aktion mit dem TRP-Kanal scheint ebenfalls der C-Terminus von TRP wichtiger zu sein als der N-Terminus. Für beide Fälle konnte in einer Chimäre aber auch eine Co-IP von TRPL bzw. TRP über den N-Terminus beobachtet werden. Im Gegensatz zu den Termini werden die Transmembranbereiche beider Kanäle für eine Interaktion nicht benötigt.
Unter der Annahme, dass eine Interaktion zwischen einer eGFP-markierten Chimäre und einer endogenen Kanaluntereinheit eine Fehllokalisation dieser endogenen Kanaleinheit ver-ursachen könnte, wurden immuncytochemische Querschnitte durch die Augen dunkel- und hell-adaptierter Fliegen angefertigt. Die Lokalisation der eGFP-markierten Chimären wurde mit Hilfe der eGFP-Fluoreszenz bestimmt, während die Lokalisation der endogenen Kanäle durch spezifische Antikörper-Markierungen ermittelt wurde.
Es zeigte sich, dass diejenigen Chimären, die eine starke Interaktion mit den endogenen Kanaluntereinheiten in den Co-IPs zeigen, eine Fehllokalisation der jeweiligen endogenen Kanäle verursachen.
Diese Arbeit klärte auf, dass TRP und TRPL in den Photorezeptoren von Drosophila aus-schließlich Homomultimere bilden. Darüber hinaus wurde deutlich, über welche Termini von TRP und TRPL die Homomultimerisierung erfolgt. Des Weiteren wurden Bereiche des TRPLs identifiziert, welche für die TRPL Translokation benötigt werden.
In the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster, the cation channels TRP and TRPL are responsible for generating the receptor potential. Previous publications have shown that the TRPL ion channel changes its subcellular localization depending on light conditions, while TRP is located in the rhabdomeres irrespective of light conditions. TRP and TRPL form tetramers. However, it is under debate in the scientific literature if TRP and TRPL form ho-momultimers only or also heteromultimers.
In the present study, co-immunoprecipitations (Co-IPs) of untagged TRP or TRPL channels demonstrated that the tetrameric channels in the photoreceptors of Drosophila are composed of homomultimers exclusively. Co-IPs of eGFP-tagged TRP or TRPL channels showed that the tetramers consist of eGFP-tagged and the corresponding untagged channel subunits.
To study the biochemical and physiological properties of the cytosolic N- and C-termini of TRP and TRPL, eGFP-tagged chimeric TRP/TRPL ion channels were generated and ex-pressed in the photoreceptor cells R1-R6 of Drosophila. The effect of these termini on trans-location of channels between the rhabdomere and the cell body and on ion channel assembly was studied.
Studies of the subcellular localization of eGFP-tagged chimeras showed that a chimera com-posed of the transmembrane regions of TRP and both the N- and the C-terminus of TRPL displayed a light-dependent translocation behavior like TRPL. Interestingly, the translocation of this chimera was much faster than the TRPL-eGFP translocation. The exchange of either the N-terminus or the C-terminus of TRPL with the respective termini of TRP caused a locali-zation of these chimeras mainly in the cell body. This localization neither corresponded to the translocation of TRPL nor to the rhabdomeric localization of TRP. Therefore, motifs inducing light-dependent translocation of TRPL must be located in both termini and are only effective in concert.
Co-IPs of the eGFP-tagged chimeras demonstrated that the C-terminus of TRPL appears to be more important than the N-terminus of TRPL. For interaction with the TRP channel the C-terminus of TRP also seems to be more important than the N-terminus. TRPL-TRPL or TRP-TRP interaction via the N-terminus could only be observed by Co-IPs in certain chimeras. In contrast to the termini, the transmembrane regions of both ion channels are not necessary for interaction.
Assuming that an interaction between the eGFP-tagged chimera and endogenous channel subunits might cause a mislocalization of the endogenous subunit, immunocytochemical stu-dies were carried out. On cross sections through the eyes of dark and light adapted flies ex-pressing eGFP-tagged chimeras the localization of these eGFP-tagged channels was visua-lized by the eGFP fluorescence, while the localization of the endogenous subunits was de-termined by labeling with specific antibodies. It was found that those chimeras which show a strong interaction with the endogenous channels in Co-IPs cause a mislocalization of the corresponding endogenous channels.
This thesis clarified that TRP and TRPL exclusively form homomutlimers in the photorecep-tors of Drosophila. Furthermore, it could be shown, which termini are responsible for the TRP and TRPL homomultimerization and which regions of the TRPL ion channel are necessary for TRPL translocation.
1304591066
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/594/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/594/pdf/Endfassung_Dissertation_Tina_Oberacker.pdf
Oberacker, Tina
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Physiologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:608
2011-06-30T13:15:39Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-6086
Membraninsertion des Phagenproteins M13 procoat in Lipidvesikel mit rekonstituiertem Escherichia coli YidC
Membrane insertion of the phage protein M13 procoat into lipid vesicles with reconstituted Escherichia coli YidC
Universität Hohenheim
Rekonstitution
Life sciences
Membraninsertion
M13 procoat
YidC
SecYEG
Liposomen
membrane insertion
reconstitution
M13 procoat
YidC
SecYEG
liposomes
Die Translokation von Proteinen über und in die Cytoplasmamembran von Escherichia coli kann über verschiedene Mechanismen bewerkstelligt werden. Die zelluläre Sekretionsmaschinerie, die Translokase SecYEG, transportiert mithilfe der ATPase SecA große ungefaltete Proteine ins Periplasma oder leitet Membranproteine an die Insertase YidC weiter. Die Membraninsertion wird von YidC katalysiert, wodurch die native Konformation der Proteine in der Lipid-doppelschicht erreicht wird. Die Translokation einiger weniger Membranproteine verläuft Sec-unabhängig nur mithilfe der Insertase YidC. Eines dieser Sec-unabhängigen Proteine stellt das Haupthüllprotein des Bakteriophagens M13 dar. Dieses Protein wird als Präprotein, genannt M13 procoat, mit der Orientierung Nin-Cin in die innere Membran inseriert und besitzt eine zentrale Loop-Domäne im Periplasma. Dieser Vorgang wird vom elektrochemischen Membran-potential und YidC katalysiert. Anschließend wird das M13 procoat durch die Leaderpeptidase zu seiner maturen Form, M13 coat (Orientierung Nout-Cin), prozessiert.
Die vorliegende Arbeit befasst sich anhand des Modellproteins M13 procoat und M13 procoat-Mutanten mit der Analyse der verschiedenen Transportsysteme der inneren Membran. Eine Mutante ist das Procoat H5EE, welches zwei zusätzliche saure Aminosäurereste zwischen Position +2 und +3 besitzt. Die Insertion dieser Mutante benötigt die Sec-Translokase und ist strikt vom Membranpotential abhängig. Die Membraninsertion von M13 procoat und abgeleiteten Proteinen in die cytoplasmatische Membran wurde in einem in vitro-Rekonstitutions- und Translokationssystem untersucht. Hierfür wurden die einzelnen Komponenten der Sec-Translokase (SecYEG und SecA), die Insertase YidC, sowie die verschiedenen Procoatproteine gereinigt und in dem in vitro-Translokationssystem eingesetzt. Die Rekonstitution von YidC in Phospholipidvesikel erfolgte abhängig von der Lipid-zusammensetzung der Membran. Die cytoplasmic-out-Orientierung entspricht der aktiven Topologie in E. coli mit den Termini im Cytoplasma. Einige Lipidkompositionen verursachten die Inversion der Orientierung, wodurch die katalytische Aktivität der Insertase beeinträchtigt wurde.
Die Procoatmutanten H5 und H5EE wurden nur in Anwesenheit von rekonstituiertem YidC in die Membran inseriert. Beide Proteine inserierten effizient in die Vesikel mit den Termini nach außen und dem periplasmatischen Loop im Inneren der Vesikel, wie die Mutante PClep von Procoat H5 mit dem C-terminalen Teil der Leaderpeptidase. Spontaninsertion in Liposomen fand nur in undichte Vesikel aus E. coli Lipiden statt. Die Membranintegrität konnte durch die Zugabe einer ausreichenden Menge an Diacylglycerin (DAG) zu den Phospholipiden verhindert werden. Undichte Phospholipide konnten durch das Zufügen von 3-4% DAG repariert werden. Die Proteine H5 und H5EE zeigten auch in vitro eine Abhängigkeit vom Membranpotential. Sie wurden effizienter in YidC-Proteoliposomen inseriert, wenn ein stabiles Membranpotential vorhanden war. Proteoliposomen mit rekonstituierter SecYEG-Translokase wurden ebenfalls auf Proteininsertion getestet. Erstaunlicherweise inserierte das Protein M13 procoat H5EE effizient in SecYEG-Proteoliposomen, nicht aber das wildtypische H5-Protein.
Translocation of proteins across or into the cytoplasmic membrane of Escherichia coli is accomplished by several mechanisms. The cellular secretion machinery, the translocase SecYEG, mediates the transport of unfolded proteins into the periplasm with the help of the ATPase SecA or passes the membrane proteins for bilayer integration to the insertase YidC. Membrane insertion is catalysed by YidC, whereby the native conformation of the proteins in the lipid bilayer is achieved. The translocation of a few membrane proteins occurs Sec-independently solely with the help of the insertase YidC. One of these Sec-independent proteins is the major capsid protein of the bacteriophage M13. This protein is inserted as preprotein, termed M13 procoat, with the orientation Nin-Cin into the inner membrane and a central loop domain located in the periplasm. This process is catalysed by the electrochemical membrane potential and YidC. M13 procoat is then processed by the leader peptidase to its mature form, M13 coat (orientation Nout-Cin).
In the present thesis an analysis of the different transport systems of the inner membrane is performed using the example of the M13 procoat protein and its mutants. One mutant is the procoat H5EE which has 2 additional acidic residues introduced between residues +2 and +3. The insertion of this mutant requires the Sec translocase and strictly depends on the electrochemical potential. Membrane insertion of M13 procoat and derived proteins into the cytoplasmic membrane was followed in an in vitro reconstitution and translocation system. Therefore, all components of the Sec translocase (SecYEG and SecA), the insertase YidC and the different procoat proteins were purified and tested with the in vitro translocation system. Reconstitution of YidC into phospholipid vesicles depended on the lipid composition for its orientation. The cytoplasmic-out orientation corresponds to the active topology in E. coli where both termini are located in the cytoplasm. Certain lipid compositions caused the inversed orientation, which affected the catalytic activity of the reconstituted insertase.
The procoat mutants H5 und H5EE were membrane inserted only in the presence of reconstituted YidC. Both proteins inserted efficiently into the vesicles with the periplasmic loop in the interior of the vesicles like the mutant PClep of procoat H5 with the C-terminal extension of the leader peptidase. Spontaneous insertion of H5 und H5EE into liposomes occurred only into leaky vesicles of the E. coli lipids. The membrane integrity was improved by the addition of an adequate amount of diacylglycerol (DAG) to the phospholipids. The leaky phospholipids were sealed by the addition of 3-4% DAG. The proteins H5 und H5EE showed a dependency of the membrane potential. Insertion occured more efficiently into YidC proteoliposomes when a stable membrane potential was generated. Proteoliposomes with reconstituted SecYEG translocase were also tested for protein insertion. Remarkedly, the protein M13 procoat H5EE efficiently inserted into SecYEG proteoliposomes, where the wildtype-like protein H5 did not.
1309432539
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/608/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/608/pdf/Diss_Natalie_Stiegler.pdf
Stiegler, Natalie
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Mikrobiologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:613
2011-07-18T15:33:19Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-6132
Molekulare Interaktionen von Milchsäurebakterien mit enterohämorrhagischen Escherichia coli und humanen Darmepithelzellen
Molecular interactions of lactic acid bacteria with enterohemorrhagic Escherichia coli and human colon epithelial cells
Universität Hohenheim
EHEC
Milchsäurebakterien
Darmepithel
Zellkultur
Interaktion
Life sciences
EHEC
lactic acid bacteria
intestinal epithelium
cell culture
interaction
Es wurden die Wechselwirkungen von potentiellen probiotischen Bakterienstämmen der Gattungen Bifidobacterium, Lactobacillus und Staphylococcus mit enterohämorrhagischen Escherichia coli (EHEC) im Zellkulturmodell (HT29-Zellen) untersucht. Es wurden 19 potentielle probiotische Stämme sowie fünf EHEC-Stämme mit verschiedenen Virulenzprofilen ausgewählt und Infektionsversuche durchgeführt. Keiner der potentiellen probiotischen Stämme zeigte eine Induktion der IL-8 Sekretion der infizierten Zellen, wohingegen alle EHEC-Stämme unabhängig von ihrem Virulenzprofil die Bildung von IL-8 in ähnlicher Menge induzierten. In Co-Infektionsversuchen mit E. coli O157:H7 Stamm EDL933 und den zu testenden benignen Bakterien wurden hemmende Effekte auf die IL-8 Sekretion der infizierten HT29-Zellen festgestellt. Von 19 untersuchten Stämmen zeigten 12 Stämme eine sehr geringe Absenkung der IL-8 Bildung der infizierten Zellen von < 30 %), sechs Stämme zeigten einen protektiven, anti-inflammatorischen Effekt auf die infizierten Epithelzellen, die IL-8 Produktion wurde um bis zu 60 % abgesenkt. Den stärksten Effekt zeigte B. breve DSMZ 20213 mit einer Absenkung der IL-8 Sekretion von 73 %. Bei der Durchführung von Co-Infektionsversuchen mit verschiedenen Stämmen einer Spezies (B. adolescentis DSMZ 20083 und DSMZ 20086 sowie L. johnsonii BFE 633 und DSMZ 10533) konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem beobachteten anti-inflammatorischen Effekt um einen Stamm-spezifischen Effekt handelt, da jeweils nur bestimmte Stämme einer Spezies diesen Effekt auslösen konnten. In nachfolgenden Co-Infektionsversuchen mit den zu testenden Bakterien und den weiteren vier EHEC-Stämmen unterschiedlicher Serotypen und Virulenzprofile, zeigte sich zudem ein Pathogen-spezifischer Effekt. Der gemessene anti-inflammatorischer Effekt variierte je nach eingesetztem pathogenen EHECStamm. In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass der beobachtete antiinflammatorische Effekt nur mit lebenden Bakterien erzielt werden konnte. Weder der Kulturüberstand von lebenden Bakterien noch inaktivierte Bakterien konnten einen Effekt auf die IL-8 Sekretion der mit EDL933 infizierten Zellen hervorrufen. Mittels High Performance Liquid Chromatography (HPLC) wurden in den Überständen der Zellkulturen 6 h nach erfolgter Infektion Milchsäure und Essigsäure detektiert. Der Einsatz dieser organischen Säuren in Infektionsversuchen mit EDL933 im Zellkulturmodell zeigte jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die IL-8 Sekretion der infizierten Zellen. Der protektive anti-inflammatorische Effekt kann somit nicht mit dem Einfluss gebildeter Säuren begründet werden. Die Induktion der IL-8 Sekretion konnte ebenfalls nicht auf einen einzelnen Virulenzfaktor zurückgeführt werden. In Infektionsversuchen mit vier Deletionsmutanten des Stammes PMK5, bei denen jeweils eines der Virulenzgene ausgeschaltet war, wurden im Vergleich zur Infektion mit dem Wildtyp-Stamm ähnliche IL-8 Sekretionen der HT29-Zellen gemessen. In Co-Infektionsversuchen mit S. pasteuri LTH 5211 und den vier Deletionsmutanten zeigten sich im Vergleich zu dem Co-Infektionsversuch mit dem Wildtyp Stamm ähnliche IL-8 Reduktionen, so dass davon auszugehen ist, dass S. pasteuri LTH 5211 die IL-8 Sekretion der mit PMK5 infizierten HT29-Zellen nicht auf der Beeinflussung eines einzelnen Pathogenitätsfaktors beruht. Die Untersuchung der Aktivierung des der IL-8 Produktion vorgeschalteten Transkriptionsfaktors?Nuklearer Faktor-kappa B? (NF-κB) in HT29-Zellen ergab für Co-Infektionsversuche eine deutlich niedrige Aktivität, als die reine EHEC-Infektion. Dies bestätigt die Ergebnisse der IL-8 Messungen, wobei weder eine Stamm- noch eine Pathogenspezifität festgestellt werden konnte. Zellstimulationen mit den potentiellen probiotischen Bakterien alleine führten zu einer Hemmung der NF-κB-Aktivität, da die gemessenen Werte niedriger als die Negativkontrolle ausfielen. Eine Genexpressionsanalyse von Toll-like-Rezeptoren, welche Bakterien auf der Zelloberfläche erkennen und die Immunantwort initiieren, zeigte für den TLR2 in dem verwendeten Zellkulturmodell keine Regulation. Die Infektion mit EDL933 reguliert den TLR4 herunter und den TLR9 hinauf. In Co-Infektionsversuchen mit L. rhamnosus GG, L. johnsonii DSMZ 10533 oder L. fermentum DSMZ 20052 und EDL933 konnte kein Einfluss auf die von EDL933 ausgelöste Regulierung des TLR4 festgestellt werden. Die durch die EHEC-Infektion ausgelösten Genexpression von TLR9 hingegen wurde durch die Co-Infektion signifikant reduziert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass es möglich ist im Zellkulturmodell protektive Effekte von Probiotika auf die Infektion mit EHEC zu messen.
The interactions of 19 benign strains of lactic acid bacteria, bifidobacteria and staphylococci with five enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) strains of different serotypes and virulence gene spectrum were investigated using a HT29 cell culture infection model. As a parameter for the infection the secretion of Interleukin 8 (IL-8) of the infected cells was analyzed by ELISA. None of the used benign strains induced an IL-8 secretion, whereas the infection with the EHEC strains leads ? independent of their virulence profile - to high amounts of IL-8. In coinfection assays with the pathogen EDL933 (O157:H7) and different test strains the secretion of IL-8 of the cultured cells was decreased by a few strains. With 12 of 19 tested strains, a weak reduction < 30 % of IL-8 secretion of HT29 cells after coinfection with EHEC O157:H7 strain EDL933 was observed. Six strains reduced the IL-8 secretion up to 60 % and the strain B. breve DSMZ 20083 decreased the IL-8 production about 73 %. Coinfection assays with different strains of one species (B. adolescentis DSMZ 20083 and DSMZ 20086 as well as L. johnsonii BFE 633 and DSMZ 10533) showed the strain specificity of the observed anti-inflammatory effect, due to different capabilities of IL-8 reduction. In further coinfection assays with different EHEC strains of the serotypes O103:H2, O26:H-, 0157:H- and O113:H21 different abilities of the benign strains to influence the infection with the different pathogen strains were noted. Therefore the protective anti-inflammatory effect is strain specific for the tested benign bacteria and also depends on the application of EHEC strains with different sero- and virulence types. Further investigations indicated the imperative of living bacteria for the observed protective effect; neither culture supernatant nor inactivated bacteria showed an effect on the IL-8 secretion of the EDL933 infected HT29 cells. The analysis of the cell culture supernatants 6 h after infection with different bacteria detected the production of lactic and acetic acid. The application of these acids in infection assays with EDL933 did not lead to an reduced IL-8 secretion of the infected cells. Therefore the production of organic acids did not explain the protective effect. The induction of IL-8 could not be traced back to the influence of a single virulence factor. Four PMK5 strains with deletions in different virulence genes induced similar IL-8 secretions in comparison to cells infected with the wild-type strain. Coinfection assays with the mutants and S. pasteuri LTH 5211 showed also similar IL-8 reductions than coinfection assays with the wild-type strain. It is to suppose that the anti-inflammatory effects of the benign bacteria do not influence a single virulence factor of the tested EHEC strains. As a second parameter the activation of the transcription factor ?Nuclear Factor kappa B? (NF-κB) of coinfected HT29 cells was monitored using a reporter-genassay. In comparison to the single EHEC-infection, the NF-κB activation was reduced by all tested lactic acid bacteria, bifidobacteria and S. pasteuri LTH 5211 in coinfection trials significantly. No strain-specificity and no pathogen-specificity could be observed. Interestingly, stimulation of the HT29 cells with benign bacteria led to inhibition of NF-κB activity, the measured values were less than the values of the negative control PBS. A gene expression analysis of toll-like receptors (TLRs), recognizing bacteria on cell surfaces and initiating the immune response, showed no regulation for TLR2. Infection with EDL933 led to down regulation of TLR4 and to up regulation of TLR9. Stimulation with L. rhamnosus GG, L. johnsonii DSMZ 10533 or L. fermentum DSMZ 20052 led neither to regulation of TLR4 nor TLR9. The benign bacteria did not influence the EHEC-induced TLR4 regulation in coinfection trials; in contrast the regulation of TLR9 was reduced significantly. The model described here is useful for screening basic effects of protective bacteria that are able to counteract EHEC-mediated effects on human cells and to study the molecular interaction between bacteria as well as between bacteria and human cultured cells.
1310995999
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/613/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/613/pdf/Dissertation_Helen_Stoeber.pdf
Stöber, Helen
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:624
2011-08-30T08:46:57Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-6242
Vergleichende Betrachtung von Mikroklima, Struktur und aus dem Xylemsaftfluss von Bäumen hochskalierter Transpiration eines tropisch-montanen Regenwaldes und eines Wolkenwaldes in Südost-Ecuador
Comparison of microclimate, structure and tree sap flow-upscaled transpiration of a tropical motane rain forest and a cloud forest in Southeast Ecuador
Universität Hohenheim
Anden
Ecuador
Tropischer Regenwald
Gebirgswald
Nebelwald
Transpiration <Pflanzen>
Physiognomie
Baumbestand
Struktur
Mikroklima
Life sciences
tropischer Bergregenwald
Wolkenwald
Bestandesklimagradient
Bestandestranspiration
Stammradiusänderung
tropical rain forest
cloud forest
stand climate gradient
stand transpiration
stem radius change
In einem tropischen Bergregenwald in 1990 m ü.NN. und in einem Wolkenwald in 2240 m ü.NN. in den Anden von Südost-Ecuador wurden die Baum-Bestandesstruktur (Baumhöhe, Basalfläche, Splintholzfläche, Bodenprojektionsfläche der Baumkronen, Blattflächenindex (LAI)) registriert und der Xylemsaftfluss der Bäume, Mikroklima (photosynthetisch aktive Strahlung, Temperatur, Luftfeuchte) im und über dem Bestand und kurzfristige Radiusschwankungen der Baumstämme gemessen. Der Messzeitraum erstreckte sich über ein Jahr und synchrone Messwerte von beiden Beständen liegen von sieben Monaten vor.
Die Struktur, der Xylemsaftfluss und das Mikroklima wurden miteinander verglichen, um zu ermitteln, ob es zwischen den Beständen Unterschiede in der Leitfähigkeit für Wasser gibt. Die Jahrestranspiration der Baumbestände wurde durch Hochskalierung des Xylemsaftflusses unter Berücksichtigung des standörtlichen Mikroklimas errechnet, mit der Basalfläche als Skalierungsparameter. Der mittlere Zuwachs der untersuchten Bäume wurde aus Stammradiusschwankungen abgeleitet.
Der Radiuszuwachs der Bäume ist im Bergregenwald um den Faktor 3-5 höher als im Wolkenwald.
Es wurden keine eindeutigen Hinweise auf eine verringerte Leitfähigkeit bei einzelnen Bäumen zwischen den untersuchten Beständen gefunden. Die im höher liegenden Wolkenwald gegenüber dem tiefer liegenden Bergregenwald geringere Bestandestranspiration (238 mm/a^-1 vs. 438 mm/a^-1) ist durch die geringere Bestandes- und Belaubungsdichte (LAI = 1,6 im Wolkenwald, LAI = 3,7 im Bergregenwald) und die höhere Luftfeuchte am höher liegenden Standort bedingt. Die kronenflächenbezogene Saftflussrate einzelner Bäume stimmt an beiden Standorten annähernd überein.
In a tropical montane rain forest 1990 m a.s.l. and a cloud forest 2240 m a.s.l. in the Andes of Southeast Ecuador, tree stand structure (tree height, tree basal area, tree sapwood area, tree crown ground projection area and leaf area index (LAI)) was registered and the sap flow rate of trees, the microclimate (photosynthetically active radiation, temperature, air moisture) inside and above the canopy, and short term stem radius changes were measured. The period of measurement was one year, and synchronous measurements exist from 7 months.
To investigate, whether the stand conductance for water differs between the two sites, their stand structure, xylem sap flow and microclimate were compared. Annual stand transpiration was calculated by means of upscaling the xylem sap flow, under inclusion of the site specific microclimate, with the basal area as scaling parameter. Mean radial stem growth was derived from stem radius changes.
Radial stem growth is higher in the montane rain forest than in the cloud forest by a factor 3-5.
No clear hints were found for different conductivity of trees between the investigated stands. The lower annual stand transpiration of the higher sited cloud forest (238 mm/a^-1) than that of the lower sited montane rain forest (438 mm/a^-1) is caused by a lower stand and foliage density (LAI = 1,6 in the cloud forest vs. LAI = 3,7 in the montane rain forest) and the higher air moisture at the higher sited stand. The crown area-related sap flow rate of single trees is approximately equal at both stands.
1314686494
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/624/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/624/pdf/Ohlemacher2010DissOnline.pdf
Ohlemacher, Christian
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Botanik
oai:opus.uni-hohenheim.de:638
2011-11-15T13:57:46Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-6382
Evaluation der Richtlinienkonformität von Verträglichkeitsprüfungen nach Artikel 6 Flora-Fauna-Habitat-Richtlinie in der Planungspraxis
Critical examination of the practical implementation of article VI, Paragraph 3 of the Habitats Directive
Universität Hohenheim
NATURA 2000
Life sciences
Habitats Directive
Gegenstand der vorliegenden Untersuchung ist eine kritische Auseinandersetzung mit der praktischen Umsetzung des Artikels 6 Abs. 3 der FFH-Richtlinie in der Vorhabenszulassung. Die Auseinandersetzung erfolgt durch die Analyse von 50 FFH-Verträglichkeitsprüfungen im Hinblick auf deren formale und methodische Qualität.
In der Summe der Bewertungen zeigen die untersuchten FFH-Verträglichkeitsprüfungen ein qualitativ solides und z.T. hohes bis sehr hohes Niveau. Nur eine kleine Zahl an FFH-VPen weist erhebliche qualitative Mängel oder Fehler auf, die in ihren Folgen ergebnisre-levant sind. Diese Mängel können durch die verbindliche Einführung angemessener Stan-dards beseitigt werden.
The dissertation presents findings of a study on the practical implementation of the Habitats Direktive, Art. 6 (3). The formal und methodological quality of 50 appropriate assessments according to the Habitats-Direktive was analysed. Overall, a solid or even high to very high level of quality was found. Only few assessments exhibited serious shortcomings or mistakes with relevant effects on the finding of the assessments. These shortcomings coud be avoided by the introdiktion of binding quality standards.
1321361866
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/638/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/638/pdf/111004_Dissertation_Matthaeus.pdf
Matthäus, Gunther
Universität Hohenheim, Fakultät Agrarwissenschaften. Institut für Landschafts- und Pflanzenökologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:637
2011-11-15T16:59:45Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-6371
Investigations on the mechanisms of sterilization by non-thermal low-pressure nitrogen-oxygen plasmas
Universität Hohenheim
Sterilisation <Hygiene>
Endospore
Kaltes Plasma
Ultraviolett-Bestrahlung
Deinococcus radiodurans
Bacillus
Life sciences
Plasmasterilisation
Bacillus subtilis
Deinococcus radiodurans
Sporeninaktivierung
UV-Bestrahlung
DNA-Reparatur
Gas plasma
Sterilization
Bacillus subtilis
Deinococcus radiodurans
Spore inactivation
UV irradiation
DNA repair
Plastic based materials are increasingly used for packaging of pharmaceuticals (especially biologicals), food or beverages and production of medical devices. Their heat sensitivity requires safe and efficient non-thermal methods for decontamination. Plasma technology has the potential to provide a suitable means since it works at low temperatures and ? in contrast to conventional methods like application of ionizing radiation or ethylene oxide exposure ? is safe to operate, is free of residues and does not alter the bulk properties of the materials. Plasmas can generate various agents potentially active in decontamination like ultra-violet (UV) radiation, radicals and other reactive particles. To acquire an approval for plasma technology as a novel sterilization method, its process safety has to be proven. The research community has proposed hypotheses and models on its mechanisms of action, which are at least partially speculative. Still little is known about the details of the biologic effects of the combination of the various plasma agents on the components of microbial cells or spores. Especially, the question remains open which components of a cell or spore are the primary targets, and which of the agents are most effective in the inactivation process. The acquisition of such knowledge is necessary to identify parameters suitable to control, monitor, and assess the safety of plasma sterilization processes.
The aims of the presented work are to elucidate which components of a cell or spore are the primary targets in low-pressure plasma sterilization, and which of the putative agents contained in the plasma are most effective in the inactivation process. To accomplish this, in the presented work suitable microbiological methods were established and the inactivation of bacterial spores and cells and fungal conidia by microwave induced low-pressure low-temperature nitrogen-oxygen plasmas was investigated. Moreover, two strategies were pursued that have hitherto not been applied in published plasma sterilization studies: (i) Using spores of Bacillus subtilis mutants to identify structural components serving as targets for sterilization with plasma and (ii) characterizing the response of Deinococcus radiodurans R1 cells to plasma treatment and identify repair processes during recovery from plasma induced damages in viable cells.
Plasmas producing a maximum of UV emission were most effective in inactivating bacterial cells and spores. The inactivation followed a biphasic kinetics consisting of a log-linear phase with rapid inactivation followed by a slow inactivation phase. A continuous model fit was applied to the experimental data allowing reliable calculation of decimal reduction values for both phases. Cells of D. radiodurans were found to be more resistant than spores of B. subtilis. For B. subtilis spores, in the course of plasma treatment damage to DNA, proteins and spore membranes were observed by monitoring the occurrence of auxotrophic mutants, inactivation of catalase (KatX) activity and the leakage of dipicolinic acid, respectively. Spores of the wild-type strain showed highest resistance to plasma treatment. Spores of mutants defective in nucleotide excision repair (uvrA) and small acid-soluble proteins (ΔsspA ΔsspB) were more sensitive than those defective in the coat protein CotE or spore photoproduct repair (splB). Exclusion of reactive particles and spectral fractions of UV radiation from access to the spores revealed that UV-C radiation is the most effective inactivation agent in the plasma, whereby the splB and ΔcotE mutant spores were equally and slightly less sensitive, respectively, than the wild-type spores. The extent of damages in the spore DNA as determined by quantitative PCR correlated with the spore inactivation.
Spore inactivation was effectively mediated by a combination of DNA damage and protein inactivation. DNA was identified to be the primary target for spore inactivation by UV radiation emitted by the plasma. Coat proteins were found to constitute a protective layer against the action of the plasma.
For the investigation of the recovery from plasma-induced damages, cells of D. radiodurans R1 were subjected to short plasma treatments with various plasmas. A part of the survivors was sublethally injured as determined by their ability to form colonies on standard medium but not on stress medium and by the observation of a prolonged lag phase. Incubation of the cells in a recovery medium after plasma treatment allowed a part of the survivors to recover their ability to grow on stress medium. This recovery strongly depended on transcriptional and translational processes and cell wall synthesis, as revealed by addition of specific inhibitors to the recovery medium. Genes involved in DNA repair, oxidative stress response and cell wall synthesis were induced during recovery, as determined by quantitative RT-PCR. Damage to chromosomal DNA caused by plasma agents and in-vivo repair during recovery was directly shown by quantitative PCR. Plasmas with less UV radiation emission were also effective in killing D. radiodurans cells but resulted in less DNA damage and lower induction of the investigated genes.
The response of D. radiodurans to plasma indicated that DNA, proteins and cell wall are primary targets of plasma, whose damage initially leads to the cells' death. Protein oxidation was more important for the killing of D. radiodurans cells than of B. subtilis spores. Thus, the plasma process parameters must regard the expected contaminating biological material in order to obtain a high-level sterilization.
The results provide new insight into the interaction of non-thermal low-pressure plasmas with microorganisms. This knowledge supports the definition of suitable parameters for novel plasma sterilization equipment to control process safety. For example, monitoring the UV intensity below 280 nm and spectrometric online measurement of bands related to excited reactive gas particle species during the process is recommended.
Polymerbasierte Materialien werden zunehmend für die Verpackung von Arzneimitteln (vor allem für Biologika), Lebensmittel oder Getränke und die Produktion von medizinischen Geräten eingesetzt. Ihre Hitzeempfindlichkeit erfordert sichere und effiziente nicht-thermische Dekontaminationsverfahren. Die Plasmatechnologie hat das Potenzial, solchen Anforderungen gerecht zu werden, da sie bei niedrigen Temperaturen arbeitet und ? im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden wie ionisierende Bestrahlung oder Ethylenoxidbegasung ? sicher zu bedienen ist, keine Rückstände hinterlässt und keine Veränderungen an den Volumeneigenschaften der Materialien hervorruft. Plasmen können verschiedene Agenzien erzeugen, die potenziell für die Dekontamination aktiv sind, zum Beispiel ultraviolette (UV) Strahlung, Radikale und andere reaktive Teilchen. Um eine Zulassung für ein neuartiges Plasma-Sterilisationsverfahren zu erlangen, muss dessen Prozesssicherheit nachgewiesen werden. Einschlägig tätige Forschungsgruppen haben Hypothesen und Modelle für die Wirkmechanismen der Plasmasterilisation vorgeschlagen, die teilweise noch spekulativ sind. Bisher sind kaum Details über die biologische Auswirkung der Kombination von verschiedenen Plasma-Agenzien auf die Komponenten von mikrobiellen Zellen oder Sporen bekannt. Insbesondere bleibt die Frage offen, welche Komponenten einer Zelle oder Spore die primären Wirkorte sind, und welche der Agenzien am effektivsten sind. Diese Kenntnisse sind notwendig, um geeignete Parameter zur Steuerung, Überwachung und Bewertung der Sicherheit von Plasma-Sterilisationsprozessen zu ermitteln.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Aufklärung, welche der Komponenten einer Zelle oder Spore die primären Wirkorte bei der Niederdruck-Plasmasterilisation sind, und welche der im Plasma enthaltenen Agenzien am effektivsten bei der Inaktivierung von Mikroorganismen sind. Hierfür wurden in der vorliegenden Arbeit geeignete mikrobiologische Methoden evaluiert und etabliert und die Inaktivierung von bakteriellen Sporen und Zellen sowie Schimmelpilzkonidien durch mikrowelleninduzierte Niederdruck-Niedertemperatur-Stickstoff-Sauerstoff-Plasmen untersucht. Weiterhin wurden zwei Strategien verfolgt, die bisher noch nicht in veröffentlichten Arbeiten zur Plasmasterilisation verwendet worden sind: (i) Verwendung von Sporen von Bacillus subtilis-Mutanten zur gezielten Untersuchung von Komponenten, die als Wirkorte für die Plasmasterilisation in Frage kommen. Und (ii), Charakterisierung der Reaktion von Deinococcus radiodurans R1 Zellen auf verschiedene Plasmabehandlungen, um biologische Prozesse in lebenden Zellen zu identifizieren, die bei der Reparatur von plasmainduzierten Schäden eine Rolle spielen.
Plasmen, die eine maximale UV-Emission erzeugen, waren am effektivsten bei der Inaktivierung von Bakterienzellen und Sporen. Die Inaktivierung folgte einer biphasischen Kinetik, die sich aus einer log-linearen Phase schneller Inaktivierung gefolgt von einer Phase langsamer Inaktivierung zusammensetzt. Für die experimentell ermittelten Datenpunkte wurde eine Kurvenanpassung mit einem stetigen biphasischen Modell durchgeführt. Dies ermöglichte die zuverlässige Berechnung von dezimalen Reduktionswerten (D-Werte) für beide Phasen. Dabei erwiesen sich Zellen von D. radiodurans R1 als resistenter als Sporen von B. subtilis. Während der Plasmabehandlung von B. subtilis Sporen wurde das Auftreten auxotropher Mutanten, die Inaktivierung der Katalase (KatX)-Aktivität sowie die Freisetzung von Dipicolinsäure untersucht. Dabei wurden Schäden an der DNA, an Proteinen beziehungsweise an den Sporenmembranen beobachtet. Sporen des Wildtyp-Stamms wiesen die höchste Resistenz gegen Plasmabehandlung auf. Sporen von Stämmen mit Mutationen an einem DNA-Reparatursystem (uvrA) und bei der Synthese der DNA-bindenden Proteine SASP (ΔsspA ΔsspB) waren empfindlicher als Sporen mit veränderter Coat-Schicht (cotE) oder als solche, denen ein funktionierendes Enzym zur direkten Reparatur des Spore-Photoproduct (splB) fehlt. Eine Abschirmung der Sporen vor reaktiven Teilchen und Teilen des UV-Spektrums zeigte, dass die UV-C Strahlung das effektivste Agens für die Inaktivierung im Plasma ist. Im Vergleich zu Wildtyp-Sporen erwiesen sich dabei die Sporen der Mutanten splB als gleich und ΔcotE als etwas weniger empfindlich. Das Ausmaß der Schäden in der Sporen-DNA wurde mittels quantitativer PCR bestimmt und korrelierte mit der Inaktivierung der Sporen.
Die Inaktivierung von Sporen wurde effektiv durch eine Kombination aus DNA-Schädigung und Proteininaktivierung bewirkt. Die DNA wurde als primärer Wirkort für die Sporeninaktivierung durch im Plasma erzeugte UV-Strahlung identifiziert. Die Coat-Schicht der Sporen bildet eine Schutzschicht gegen die Wirkung des Plasmas.
Um die Reparatur von plasmainduzierten Schäden zu untersuchen, wurden Zellen von D. radiodurans R1 kurzen Behandlungen mit unterschiedlichen Plasmen unterzogen. Ein Teil der Überlebenden konnte Kolonien auf Standard-Medium, nicht aber auf Stressmedium bilden, wobei zusätzlich eine verlängerte Lag-Phase beoabachtet wurde. Diese Überlebenden wurden als subletal geschädigt gewertet. Durch Inkubation der Zellen in einem Recovery-Medium konnte ein Teil der Überlebenden sich so weit erholen, dass sie ihre Fähigkeit, auf Stressmedium zu wachsen, wieder erlangten. Diese Erholung war maßgeblich abhängig von Transkriptions- und Translationsprozessen sowie von der Zellwandsynthese. Dies zeigte sich durch die Zugabe von entsprechenden spezifischen Inhibitoren zum Recoverymedium. Eine Analyse mittels quantitativer RT-PCR zeigte, dass Gene während der Erholungsphase induziert waren, die an der DNA-Reparatur, an der Resistenz gegen oxidativen Stress sowie an der Zellwandsynthese beteiligt sind. Sowohl durch das Plasma verursachte Schäden an chromosomaler DNA als auch deren Reparatur in-vivo während der Erholungsphase wurden durch direkte Messung mit quantitativer PCR demonstriert. Plasmen mit weniger UV-Emission waren ebenfalls effektiv bei der Abtötung von D. radiodurans Zellen, sie erzeugten jedoch weniger DNA-Schädigung und eine niedrigere Induktion der untersuchten Gene.
Das Verhalten von D. radiodurans Zellen nach Plasmabehandlung weist darauf hin, dass die DNA, Proteine und Zellwand primäre Wirkorte des Plasmas sind, deren Schädigung zuerst zum Absterben der Zellen führt. Die Proteinoxidation hatte mehr Einfluss auf die Sterilisation von D. radiodurans Zellen als bei B. subtilis Sporen. Die Auslegung der Plasmaprozesse muss folglich die Art des in der jeweiligen Anwendung zu erwartenden kontaminierenden biologischen Materials berücksichtigen, um eine hohe Sterilisationssicherheit zu erzielen.
Die Ergebnisse liefern neue Einblicke in die Wechselwirkungen von nicht-thermischen Niederdruck-Plasmen mit Mikroorganismen. Dieses Wissen unterstützt die Definition von geeigneten Parametern für neuartige Plasma-Sterilisationsanlagen zur Kontrolle der Prozesssicherheit. Zum Beispiel ist eine Überwachung der UV-Intensität unterhalb von 280 nm sowie eine spektrometrische Online-Messung von Emissionsbanden angeregter reaktiver Teilchen während des Prozesses zu empfehlen.
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eng
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/637/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/637/pdf/Dissertation_Roth_2011.pdf
Roth, Stefan
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:659
2011-12-01T14:45:43Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-6595
Molekulare Dynamik der YidC-Membraninsertase aus Escherichia coli
Molecular dynamic of the membrane insertase YidC of Escherichia coli
Universität Hohenheim
Rekonstitution
Fluoreszenzspektroskopie
Life sciences
YidC
Pf3 coat
Tryptophan
Liposomen
Escherichia coli
YidC
Pf3 coat
tryptophan
liposomes
Escherichia coli
Die YidC-Insertase des Gram-negativen Bakteriums E. coli ermöglicht die Insertion von Proteinen in die Cytoplasmamembran. YidC selbst ist ebenfalls in der Cytoplasmamembran lokalisiert und durchspannt diese mit sechs Transmembrandomänen. Dabei sind der N- und der C-Terminus im Cytoplasma lokalisiert. Die sechs Transmembrandomänen werden durch drei periplasmatische Bereiche (P1, P2 und P3) und zwei im Cytoplasma lokalisierte Bereiche(C1 und C2) verbunden. Es ist bekannt, dass durch die Bindung des YidC-abhängigen Proteins Pf3 coat Konformationsänderungen in der Tertiärstruktur von YidC verursacht werden. Diese molekulare Dynamik von YidC wurde in dieser Arbeit mittels ?steady-state? und zeitaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie genauer untersucht. Dafür wurden drei YidC-Tryptophanmutanten verwendet, die an Position 354 in der ersten periplasmatischen Domäne P1, an Position 454 im zweiten periplasmatischen Bereich P2 bzw. an Position 508 nahe des dritten periplasmatischen Bereichs P3 jeweils einen Tryptophan-Rest enthielten. Zusätzlich wurde eine Doppel-Tryptophanmutante verwendet, die zwei Tryptophan-Reste in der P1-Domäne an Position 332/334 enthielt. Diese Tryptophan-Reste dienten als intrinsische Fluorophore. Zunächst wurde gezeigt, dass die YidC-Tryptophanmutanten den Wachstumsdefekt des E. coli YidC-Depletionsstammes JS7131 komplementieren konnten und zudem in der Lage waren, das strikt von YidC abhängige Protein PClep in die Cytoplasmamembran des Depletionsstammes zu inserieren. Dies stellte sicher, dass die YidC-Tryptophanmutanten funktionell waren. Die gereinigten YidC-Tryptophanmutanten wurden in Liposomen rekonstituiert und mit Pf3W0 coat, einer Tryptophan-freien Mutante von Pf3 coat, titriert. Dies ermöglichte spektroskopische Untersuchungen jedes einzelnen periplasmatischen Bereichs (P1, P2 und P3) von YidC vor und nach Bindung von Pf3W0 coat Protein. Analysen der Emissionsspektren und der Fluoreszenz-Lebensdauern der Detergenz-solubilisierten sowie der rekonstituierten YidC-Tryptophanmutanten vor Bindung von Pf3 coat ließen darauf schließen, dass sich der jeweilige Tryptophan-Rest der Einzel-Tryptophanmutanten (YidCW354, YidCW454 und YidCW508) in der Grenzschicht von Wasser und Membran befand. Diese Ergebnisse sind vereinbar mit der bisher bekannten Membrantopologie von YidC. Die Tryptophan-Reste der Doppel-Tryptophanmutante (YidC2W) wiesen Fluoreszenzeigenschaften auf, die in Einklang mit der bekannten Struktur der P1-Domäne stehen, wonach sie sich in einem teilweise zugänglichen, alpha-helikalen Bereich befinden. Die Analyse der Emissionsspektren und der Fluoreszenz-Lebensdauern führten des Weiteren zur Erkenntnis, dass durch Bindung des Pf3W0 coat Proteins Konformationsänderungen in allen drei periplasmatischen Bereichen (P1, P2 und P3) von YidC stattfanden. Anisotropie-Messungen zeigten, dass diese Konformationsänderungen zu Bewegungen der Tryptophan-Reste in allen drei periplasmatischen Bereichen der YidC-Tryptophanmutanten führten, wobei die periplasmatische Domäne P1 mit den Tryptophan-Resten W332/W334 und der dritte periplasmatische Bereich P3 mit dem Tryptophan-Rest W508 am signifikantesten betroffen waren.
The membrane insertase YidC of the Gram-negative bacterium E. coli enables the insertion of proteins into the cytoplasmic membrane. YidC itself is localized in the cytoplasmic membrane and spans the membrane six times with its N- and C-termini localized in the cytoplasm. These six transmembrane segments are connected by three periplasmic loops (P1, P2 and P3) and two cytoplasmic loops (C1 and C2). It is known that the binding of the YidC-dependent protein Pf3 coat induces conformational changes in the tertiary structure of YidC. This molecular dynamic of YidC was examined in detail with steady-state and time-resolved fluorescence spectroscopy. Therefore, three tryptophan mutants of YidC with one tryptophan residue each, at position 354 in the first periplasmic domain P1, at position 454 in the second periplasmic region and at position 508 near the third periplasmic region, respectively, were used. Additionally, a double tryptophan mutant was used which contained two tryptophan residues at position 332/334 of the domain P1. These tryptophan residues were used as intrinsic fluorophores. First, it was shown that the tryptophan mutants of YidC complemented the growth defect of the E. coli YidC-depletion strain JS7131. Additionally, the mutants were able to insert the strictly YidC-dependent PClep protein into the cytoplasmic membrane of the depletion strain. Thus, the functionality of the tryptophan mutants of YidC was ensured. Purified tryptophan mutants of YidC were reconstituted into liposomes and titrated with Pf3W0 coat, a tryptophan free mutant of Pf3 coat protein allowing spectroscopic studies of each periplasmic region (P1, P2 and P3) before and after binding of Pf3W0 coat protein. Analysis of the emission spectra and the fluorescence lifetimes of detergent solubilized as well as of the reconstituted YidC tryptophan mutants before binding of Pf3W0 coat revealed that the tryptophan residue of each single tryptophan mutant (YidCW354, YidCW454 and YidCW508) was localized at the membrane/water interface. These results are consistent with the proposed membrane topology of YidC. The tryptophan residues of the double tryptophan mutant of YidC (YidC2W) showed fluorescence properties consistent with their localization in a partially exposed alpha-helical segment of the P1 domain. Analysis of the emission spectra and the fluorescence lifetimes provided additional evidence that binding of Pf3W0 coat induced conformational changes of all periplasmic regions (P1, P2 and P3) within YidC. Measurements of fluorescence anisotropy showed that the conformational changes affected motions within all three periplasmic regions of the YidC tryptophan mutants, whereas the periplasmic domain P1 with the tryptophan residues W332/W334 and the third periplasmic domain P3 with the tryptophan residue W508 were affected most significantly.
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ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/659/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/659/pdf/Diss_Nora_Imhof.pdf
Imhof, Nora
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Mikrobiologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:661
2011-12-08T14:07:24Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-6613
Untersuchungen zur autonomen und YidC-vermittelten Membraninsertion von Pf3 coat-Protein mit Hilfe Fluoreszenz-spektroskopischer Einzelmolekülmessungen
Analyses of the autonomous und YidC-driven membrane insertion of Pf3 coat protein by spectroscopical single molecule measurements
Universität Hohenheim
Biomembran
Fluoreszenz
Life sciences
Membraninsertion
Membraninsertase YidC
Pf3 coat
EInzelmolekülmessung
Hydrophobizität
membrane insertase YidC
membrane translocation
Pf3 coat protein
single molecule
hydrophobicity
Das Haupthüllprotein des Bakteriophagen Pf3, Pf3 coat, ist ein 44 Aminosäuren großes, alpha-helikales, stäbchenförmiges Protein. Auf Grund seiner geringen Größe und der einfachen Struktur wird es nach der Synthese im Cytoplasma mit Hilfe der Insertase YidC in die Membran eingebaut. Dort setzen sich die Pf3 coat-Proteine zur Phagenhülle zusammen.
Die Proteinvariante 3L-Pf3 coat besitzt einen verlängerten, transmembranen Bereich durch die Einführung von drei zusätzlichen Leucinen zwischen den Aminosäuren Ile26 und Ile27. Zusätzlich ist die Hydrophobizität dieser Domäne erhöht. Das Protein ist in der Lage, sich unabhängig von YidC in eine Membran einzubauen (Serek et al., 2004).
In dieser Arbeit wurde mit Hilfe einer neu entwickelten physikalischen Messmethode anhand weiterer Proteinvarianten untersucht, ob die Verlängerung der transmembranen Domäne (TMD), oder aber die Erhöhung der Hydrophobizität für den autonomen Membraneinbau die zentrale Rolle spielt. Dafür wurden zwei Proteinvarianten konzipiert, die jeweils eine der veränderten Eigenschaften des 3L-Pf3 coat-Proteins tragen. Das verlängerte Protein GAT-Pf3 coat trägt bei gleichbleibender Hydrophobizität drei zusätzliche Aminosäuren (Glycin, Alanin und Threonin) in der TMD. Die zweite Proteinvariante, 2M-Pf3 coat, besitzt durch den Austausch der Aminosäuren Ala30 und Ala31 gegen zwei Methionine bei unveränderter Länge der TMD eine erhöhte Hydrophobizität.
Für den Einsatz optisch-physikalischer Messmethoden wurden die Proteine mit einem Fluoreszenz-farbstoff verbunden. Dafür wurde ein Cysteinrest des Proteins über eine Maleimid-Verbindung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Atto520-maleimid markiert. Pf3 coat-Protein selbst enthält keine Cysteinreste. Daher erhielten die NC-Varianten, und auch das wildtypische Pf3 coat-Protein, einen Aminosäureaustausch an Position 3 (NC-Pf3 coat). Dort wurde ein Serin gegen ein Cystein ausgetauscht. Im Falle von wt-Pf3 coat und 3L-Pf3 coat wurden außerdem CC-Varianten hergestellt. Hier wurde das C-terminale Phenylalanin gegen ein Cystein ausgetauscht. So konnte zusätzlich zum Einbau die Orientierung des Proteins in der Membran bestimmt werden.
Mit Hilfe der markierten Proteine wurde die Methode der optisch-physikalischen Einzelmolekül-messung entwickelt, mit deren Hilfe man den Einbau des Proteins in DOPC-Liposomen in Echtzeit verfolgen konnte. Durch die Nutzung der Fluoreszenzlöschung konnte dabei zwischen der Bindung an die Membran und dem Einbau unterschieden werden. Es wurde festgestellt, dass sowohl eine Verlängerung der TMD als auch eine gesteigerte Hydrophobizität einen autonomen Einbau in die Membran bewirken können.
Pf3 coat is the capsid protein of the bacteriophage Pf3. The phage leaves the host cell by continuous extrusion without damaging the cell. The protein itself consists of 44 amino acid residues and has a rod-like shape. Because of its simple structure, the protein needs only the help of the insertase YidC to insert into the bacterial inner membrane.
3L-Pf3 coat, a protein mutant with three additional leucine residues in the center of the transmembrane region (TMD), has an increased hydrophobicity. It is independent of YidC and inserts into the membrane autonomously (Serek et al., 2004).
In this work, a newly developed physical method was used to find out whether the elongation or the increased hydrophobicity accounts for the autonomous insertion of the protein. For this reason, two new protein mutants were constructed. Each mutant has only one of the changed properties of the 3L-Pf3 coat protein: GAT-Pf3 coat has an elongated TMD with three additional residues (glycine, alanin and threonine). The second mutant, 2M-Pf3 coat, shows an increased hydrophobicity due to the substitution of two alanine residues by two methionine residues at the positions 30 and 31. So it had an increased hydrophobicity like 3L-Pf3 coat.
The above mentioned proteins, wt-Pf3 coat and its mutants, were modified with a fluorescent label to follow the proteins with optical methods. The Proteins were first modified with a single cysteine and then labeled by a fluorescent marker, Atto520 maleimid. Proteins with a labeled N-terminal tail were called NC-Pf3 coat, whereas CC-Pf3 coat had a labeled C-terminal tail. In addition, the orientation of the protein in the membrane was identified by quenching the fluorescence of the NC- and CC- labeled proteins.
A new method employing single molecules was developed using fluorescence correlation spectroscopy. This method allows real time observations of binding and insertion of the protein into semisynthetical liposomes. By using fluorescent quenching the membrane insertion and binding were distinguished.
It became clear that both the elongation of the TMD as well as an increased hydrophobicity play a crucial role in the autonomous insertion of the protein into the membrane.
Therefore, the interaction between the hydrophobic region of the protein and the hydrophobic core region of the membrane is important for the binding of the protein and its insertion into the membrane.
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ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/661/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/661/pdf/Dissertationsschrift_Schoenbauer_Endversion.pdf
Schönbauer, Anne-Kathrin
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Mikrobiologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:762
2012-10-11T10:08:02Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-7623
ATP4 and Wnt-signaling are required for ciliogenesis and left-right axis development of Xenopus
Universität Hohenheim
Embryonalentwicklung
Krallenfrosch
Protonenpumpe
Wasserstoff-Kalium-ATPase
Wnt-Proteine
Asymmetrie
Lateralität
Life sciences
ATP4a
links-rechts
Symmetriebruch
Ciliogenese
Wnt-Signalweg
ATP4a
left-right axis
development
ciliogenesis
Wnt-signaling
The vertebrate body plan displays left-right (LR) asymmetries of organ placement superimposed on an overt bilaterally symmetrical organization. Symmetry is broken during embryogenesis, and asymmetric gene expression precedes asymmetric organ morphogenesis. The proton/potassium pump ATP4 was shown to play a role in LR-development of the frog Xenopus laevis as well as in other deuterostomes. Two opposing models of symmetry-breakage were proposed, the ?ion-flux? and the ?leftward flow? model. The former proposed that symmetry was broken by LR-asymmetric expression of the a-subunit of ATP4 during cleavage stages. The latter claimed a cilia-based leftward flow at the gastrocoel roof plate (GRP) to take center stage during neurulation, i.e. a day later in development.
In the present thesis work, the role of ATP4a in symmetry-breakage was re-addressed and evidence for symmetrical expression and function of ATP4a was gathered. ATP4a was shown to be required for two Wnt-signaling dependent steps during the setup of cilia driven leftward flow at the GRP: (1) Wnt/b-catenin (b-cat) dependent expression of Foxj1 during gastrulation, and (2) Wnt/planar cell polarity (PCP) dependent posterior localization of motile cilia during neurulation. These data challenge the ?ion-flux? hypothesis and argue for a conserved ATP4- and cilia-dependent symmetry-breakage mechanism throughout the vertebrates.
Furthermore, the function of Wnt-signaling components was analyzed in the context of GRP-formation: The receptor Frizzled 8 (Fz8) and b-cat were required for Foxj1 expression during gastrulation. Morphogenesis of the GRP, posterior polarization of motile cilia and expression of Xnr1 and Coco in somitic cells were all required for LR-development. Loss of non-canonical Xwnt11b-signaling perturbed these process, suggesting that non-canonical Wnt-signaling branches, in addition to Wnt/PCP, were relevant for LR-development.
ATP4-mediated Wnt-signaling was also required for Foxj1 expression and motile cilia in other epithelia during Xenopus development, i.e. the skin, floor plate and the ependymal cell layer. In the floor plate b-cat was required for Foxj1 expression downstream of Hedgehog-signaling. In the skin mucociliary epithelium ATP4a and Wnt/b-cat were required downstream of Notch/Delta-mediated cell-type specification of multiciliated cells.
This was also true for a new cell type of serotonergic cells described here, which was characterized morphologically, by analysis of gene expression and response to manipulations of Wnt- and Notch/Delta-signaling.
In summary, the data presented in this thesis suggest a conserved function of ATP4a and Wnt-signaling in vertebrate symmetry-breakage and Foxj1-dependent ciliogenesis in Xenopus.
Wirbeltiere weisen Links-Rechts-(LR-)Asymmetrien in der Positionierung ihrer inneren Organe auf, welche von dem im Allgemeinen bilateral-symmetrischen Körperbauplan überlagert werden. Die bilaterale Symmetrie wird während der Embryonalentwicklung gebrochen, dabei geht die asymmetrische Aktivität von Genen der asymmetrischen Organmorphogenese voraus. Der Protonen/Kalium-Pumpe ATP4 wurde eine Rolle während der LR-Entwicklung von Xenopus laevis und weiteren Deuterostomiern zugesprochen. Zum Ablauf des Symmetriebruchs wurden jedoch zwei gegensätzliche Modelle vorgeschlagen: das ?Ionen-Fluss?- und das ?Flüssigkeitsstrom?-Modell. Während das erste Modell impliziert, dass eine LR-asymmetrische Verteilung der a-Untereinheit von ATP4 in Furchungsstadien zum Symmetriebruch führt, schlägt das zweite Modell vor, dass ein cilienabhängiger, linksgerichteter Flüssigkeitsstrom über Zellen der Archenteron-Dachplatte (GRP) zum Symmetriebruch während Neurulastadien führt. Dies wäre ein Tag später in der Entwicklung als vom ?Ionen-Fluss? Modell vorgeschlagen.
In dieser Arbeit wurde die Funktion von ATP4a während des Symmetriebruchs nochmals näher untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse legten eine symmetrische Verteilung und Funktion von ATP4 während der LR-Entwicklung nahe. Es konnte gezeigt werden, dass die Funktion von ATP4a in zwei Wnt-abhängigen Signalprozessen für die Entstehung des linksgerichteten Flüssigkeitsstroms benötigt wurde: (1.) Für die Wnt/b-Catenin-abhängige Expression von Foxj1 während der Gastrulation, und (2.) für die Wnt/PCP-abhängige (planare Zellpolarität) posteriore Positionierung von motilen Cilien während der Neurulation. Diese Daten stellten die ?Ionen-Fluss?-Hypothese in Frage und unterstützten die Idee eines konservierten Symmetriebruch-Mechanismus in Wirbeltieren, welcher ATP4- und Cilien-abhängig ist.
Zudem wurden die Funktionen von weiteren Komponenten des Wnt-Signalwegs währen der Entstehung der GRP untersucht: Der Rezeptor Frizzled 8 (Fz8) und b-Catenin wurden für die Expression von Foxj1 während der Gastrulation benötigt. Funktionsverlust des non-kanonischen Liganden Xwnt11b hingegen störte die Morphogenese der GRP, die posteriore Ausrichtung von motilen Cilien, sowie die Expression von Coco und Xnr1 in somitischen Zellen der GRP. Dies legte nahe, dass neben Wnt/PCP die Aktivität weiterer non-kanonischer Signalzweige des Wnt-Signalweges für die LR-Entwicklung notwendig waren.
ATP4-abhängige Wnt-Signalaktivität war auch für die Expression von Foxj1 und die Entstehung motiler Cilien in anderen ciliierten Epithelien während der Entwicklung von Xenopus notwendig: z.B. in der Haut, der neuralen Bodenplatte und im Ependym. In der Bodenplatte des Neuralrohrs wurde b-Catenin dem Hedgehog-Signalweg nachgeschaltet für die Foxj1 Expression benötigt. Im mucociliären Epithel der Haut wurden ATP4a und Wnt/b-Catenin gebraucht, nachdem die Zellen über den Notch/Delta-Signalweg spezifiziert wurden. Diese Art der Regulation wurde auch in einem neuen Zelltyp serotonerger Zellen beobachtet, welcher hier mittels morphologischer Analyse, Analyse der Genexpression und anhand der Reaktion auf Manipulation des Notch/Delta-Signalwegs charakterisiert wurde.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die in dieser Dissertation vorgelegten Daten für eine evolutionäre Konservierung der Funktionen von ATP4a und des Wnt-Signalweges beim Symmetriebruch der Wirbeltiere sprechen, sowie eine Verbindung zwischen ATP4a und Wnt bei der Foxj1-abhängigen Entstehung von Cilien in Xenopus herstellen.
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eng
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2012/762/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2012/762/pdf/Walentek_Dissertation.pdf
Walentek, Peter
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Zoologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:764
2012-10-11T12:51:16Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-7649
Goosecoid und Calponin : zwei neue Regulatoren des PCP-Signalwegs
Goosecoid and Calponin : two new regulators of the PCP-pathway
Universität Hohenheim
Embryologie
Entwicklungsbiologie
Krallenfrosch
Maus
Organisator <Embryologie>
Gastrulation
Life sciences
Neurulation
Planare Zellpolarität
Wnt-Signalweg
Neuralleistenzellen
konvergente Extension
Planar Cell Polarity
noncanonical Wnt
convergent extension
Xenopus
neural crest cells
Bei der Embryonalentwicklung von Wirbeltieren spielen insbesondere morphogenetische Umgestaltungen wie Zellmigration oder konvergente Extension (CE), bei der sich ein Gewebe streckt, eine wichtige Rolle. Der planare Zellpolaritäts-Signalweg (PCP; ?planar cell polarity?), ein nicht-kanonischer Wnt-Signalweg, gewährleistet die intrazelluläre Polarität der Zellen entlang der Embryonalachsen. Dieser führt über die polarisierte Lokalisierung von Proteinen wie Dishevelled, Vangl2 und Prickle an die Zellmembran zur Aktivierung von kleinen GTPasen wie Rho und Rac und damit zur Ausrichtung des Zytoskeletts. Diese Polarität der Zellen wird für CE, bei der bipolare Zellen interkalieren, während der Gastrulation und während der Neurulation benötigt. CE führt dabei zur Elongation der Chorda und der Neuralplatte, was den Neuralrohrschluss ermöglicht. In Vorarbeiten wurde beschrieben, dass die dorsale Überexpression des Transkriptionsfaktors Goosecoid (Gsc) in der Maus und im Frosch zu Neuralrohrschlussdefekten führt. In der vorliegenden Arbeit wurde durch Funktionsgewinnexperimente in vivo und ex vivo eine Inhibition konvergenter Extension durch Gsc gezeigt. Der Funktionsgewinn von Gsc verhinderte die Membranlokalisierung von Dishevelled in animalen Polkappenexplantaten, was eine Störung des PCP-Signalwegs anzeigt. Gsc-induzierte Fehlbildungen konnten durch Co-Injektion von Kernkomponenten des PCP-Signalwegs wie Vangl2 oder Prickle kompensiert werden. Auch die Überexpression der kleinen GTPase RhoA und des Liganden Wnt11 verhinderte den Effekt des Gsc-Funktionsgewinns. Brachyury, ein transkriptioneller Aktivator von Wnt11 und bekanntes Zielgen von Gsc, konnte die Wirkung von Gsc ebenso partiell umkehren. Diese Experimente legten eine neue Rolle von Gsc als Repressor PCP-induzierter CE nahe. Durch Funktionsverlustexperimente wurde im Frosch die endogene Funktion von Gsc untersucht. Aufgrund der konservierten und lokalisierten Expression von Gsc im Spemann-Organisator und der Induktion von Doppelachsen war eine Funktion von Gsc bei der Spezifizierung dorsaler Gewebe vorhergesagt worden. Die fehlenden Defekte in der Gsc Knock-out Maus standen allerdings dazu im Widerspruch. Die hier beschriebene Repression des PCP-Signalwegs durch Gsc deutete auf eine Funktion bei der Regulierung von Zellbewegungen hin. Dazu passt die Expression von Gsc in den Zellen des frühen Organisators, die während der Gastrulation zuerst einwandern und das prächordale Mesoderm bilden. In den nachfolgenden Zellen der Chorda findet dagegen CE statt. Gsc-Funktionsverlust reduzierte die Prächordalplatte und, als Konsequenz daraus, den Augenabstand. Die Activin-induzierte CE in animalen Polkappenexplantaten wurde durch Gsc-Funktionsverlust zusätzlich verstärkt. Damit konnte gezeigt werden, dass das Organisatorgen Gsc durch Repression des PCP-Signalwegs Zellbewegungen während der frühen Gastrulation reguliert.
PCP steuert neben CE auch die gerichtete Wanderung von Neuralleistenzellen. Vorarbeiten zeigten eine Expression von Calponin2 in Neuralleistenzellen. Auch wurde eine Inhibition von Calponin1 durch die Rho-Kinase beschrieben. Ein Myc-Fusionskonstrukt des Aktin-Bindeproteins Calponin2 war in Xenopus in Zellfortsätzen und migrierenden Neuralleistenzellen lokalisiert. Der Funktionsverlust von Calponin2 verhinderte die gerichtete Bildung von Zellfortsätzen in Neuralleistenzellexplantaten und damit die Wanderung der Neuralleistenzellen. Dabei bildeten sich zusätzliche Stressfasern im zentralen Zellbereich auf Kosten des peripheren Aktin-Zytoskeletts. Der PCP-Signalweg aktiviert auf der der Wanderungsrichtung entgegengesetzten Seite RhoA und inhibiert Rac, was zur gerichteten Wanderung der Neuralleistenzellen führt. Dies implizierte eine Interaktion des PCP-Signalwegs und Calponin2 bei der Neuralleistenzellmigration, die durch Epistasisexperimente in vivo und in Neuralleistenzellexplantaten untersucht wurde. Der Funktionsverlust von Calponin2 konnte dabei den Funktionsverlust von nicht-kanonischem Wnt oder der Rho-Kinase retten. Damit gewährleistet das Aktinbindeprotein Calponin2 als Effektor des PCP-Signalwegs die Polarisierung des Aktin-Zytoskeletts in migrierenden Neuralleistenzellen. Zusammenfassend wurden in der vorliegenden Arbeit mit Calponin2 und Gsc zwei neue Regulatoren von PCP und Zellwanderung beschrieben. Daraus ergeben sich neue Ansätze zur Untersuchung der transkriptionellen Kontrolle des Zellwanderungsverhaltens (Gsc) und der nachgeschalteten Modulation des Zytoskeletts (Calponin2).
Vertebrate embryogenesis relies on morphogenetic movements such as cell migration and convergent extension (CE). The planar cell polarity (PCP) branch of non-canonical Wnt signaling governs the orientation of cells along embryonic axes. PCP-signaling leads to intracellular polarization of proteins such as Dishevelled, Prickle and Vangl2, resulting in activation of small GTPases such as Rho and Rac, and consequently oriented alignment of the cytoskeleton. This polarity is required for CE, namely for the intercalation of bipolar cells, during gastrulation and neurulation. CE promotes elongation of the notochord and the neural plate, which is a prerequisite of neural tube closure. Previous work had shown that misexpression of the transcription factor Goosecoid (Gsc) in the primitive streak of the mouse and in the dorsal marginal zone of the frog led to neural tube closure defects. The present work demonstrates that misexpression of Gsc inhibits CE in vivo and ex vivo. Gsc gain-of-function (Gsc-GOF) prevented the membrane localization of Dishevelled in the frog animal cap assay, suggesting a disturbance of the PCP pathway. The Gsc-induced phenotypes could be rescued by co-injection of core components of the PCP pathway, Vangl2 and Prickle. Overexpression of RhoA and the non-canonical Wnt11, rescued the effect of Gsc-GOF. Brachyury, a transcriptional activator of Wnt11 and known target of Gsc, was also able to rescue the effect of Gsc-GOF. Gsc thus acted as a repressor of PCP-mediated CE. Furthermore, loss of function experiments in Xenopus were conducted to reveal the endogenous function of Gsc. Due to the conserved and distinct expression of Gsc in Spemann's organizer and the induction of double axes upon injection of Gsc into the ventral marginal zone in Xenopus, a function of Gsc in the specification of dorsal tissue was predicted. The lack of gastrulation defects in the Gsc knock-out mouse, however, questioned an early role of Gsc. The repression of the PCP pathway by Gsc-GOF suggested a novel role of Gsc in the regulation of cell movements. Interestingly, Gsc is expressed in a distinct population of cells in the early organizer, which migrate out of the organizer during early gastrulation to form the prechordal mesoderm. In contrast, the subsequent involuting cells of the notochord undergo CE. Gsc knock-down in the frog reduced the prechordal plate resulting in a narrowing of eye distance. Furthermore, activin-induced CE in animal cap explants was enhanced by Gsc loss-of-function. These findings are consistent with a novel function of the organizer gene Gsc in the regulation of cell movements during early gastrulation, namely the repression of PCP-mediated CE as a prerequisite of active migration of the prechordal mesoderm.
The directed migration of neural crest cells represents another embryological process which depends on PCP-signaling. Previous work showed expression of Calponin2 in neural crest cells. Moreover, inhibition of Calponin1 by the Rho-Kinase has been described. In Xenopus, Calponin2 localized to cell protrusion of delaminating and migrating neural crest cells. Loss of function of Calponin2 prevented the polarized outgrowth of cell extensions in neural crest explants and thus migration of neural crest cells. Moreover, additional stress fibers were formed in the central area of neural crest cells at the expense of the peripheral, cortical actin cytoskeleton. The PCP pathway directs migration via the activation of RhoA and inhibition of Rac in the cell compartment opposed to the leading edge. This suggested an interaction of PCP-signaling and Calponin2 during the migration of neural crest cells, which was examined by rescue experiments in vivo and in neural crest explants. Calponin2 knock-down rescued Wnt11 and Rho-Kinase loss-of-function, strongly suggesting that the actin-binding protein Calponin2 acts as an effector of the PCP pathway and directs the polarization of the actin cytoskeleton in migrating neural crest cells. In summary the present work involved two novel regulators of PCP-mediated CE, Gsc at the transcriptional level and Calponin2 as an effector of the actin cytoskeleton.
1349952676
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2012/764/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2012/764/pdf/Dissertation_Barbel_Ulmer.pdf
Ulmer, Bärbel Maria
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Zoologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:773
2012-11-13T13:25:12Z
ddc:570
pub-type:8
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Otiorhynchus spp. (Coleoptera: Curculionidae) as pests in horticulture: genetics and management options with entomopathogenic fungi
Universität Hohenheim
Rüsselkäfer
Entomopathogene Pilze
Endosymbiont
Fingerprint
Life sciences
454 Pyrosequenzierung
weevils
entomopathogenic fungi
endosymbionts
454 pyrosequencing
fingerprint
Worldwide, weevils of the genus Otiorhynchus (Coleoptera: Curculionidae) cause damage with detrimental economic effects to many horticultural crops due to the root feeding of their larvae as well as foliage feeding of their adults. Aside from the black vine weevil Otiorhynchus sulcatus, which is the best-known pest within this genus, numerous other Otiorhynchus species have been increasingly recognized as pests in recent years. Nocturnal adult weevils and soil-inhibiting larvae are in principle difficult to control with biological or chemical plant protection products. In addition, each Otiorhynchus species shows a different phenology or may have a varying susceptibility towards plant protection products. Therefore, the exact species identification of the respective weevil pest is a prerequisite for the development of efficient control strategies. While adult weevils can be distinguished by phenotypical characteristics, the determination of Otiorhynchus eggs, larvae and pupae, only on the basis of morphological features, is nearly impossible. For that reason, a molecular diagnostic method, which allows the species determination of 16 Otiorhynchus and eight other weevil species, independent of their developmental stage, was developed. This diagnostic method might be used in future for fast and cost-efficient species identification of weevils in plant protection.
The application of entomopathogenic nematodes is a well established method for biological control of O. sulcatus larvae. Another biocontrol strategy is the application of entomopathogenic fungi. So far, both entomopathogenic fungi and nematodes have been used mainly against the black vine weevil. As less is known about the effectiveness of entomopathogenic fungi against different Otiorhynchus species, the present thesis analysed the efficacy of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana, Isaria fumosorosea and Metarhizium anisopliae (formulated in the commercially available products Naturalis®, PreFeRal® WG and GranMet-P®, respectively) against different developmental stages of several Otiorhynchus species under laboratory conditions. Infection experiments revealed that different species of adult Otiorhynchus weevils show a different susceptibility to the analysed entomopathogenic fungi. In addition, a method to quantify the efficacy of entomopathogenic fungi against adult Otiorhynchus spp. under field conditions was developed.
Worldwide, entomopathogenic fungi, in particular the species B. bassiana, are used for biological insect pest control. They are either incorporated into the potting media at the time of planting or applied directly onto the plant or onto the surface of the soil. While the effect of entomopathogenic fungi against insects has been well studied, little is known so far about their fate, spread and influence on the naturally occurring soil fungi. As decomposers of dead organic material or as mycorrhizal symbionts of plants, fungi play an important role in the terrestrial ecosystem. New insights into the fate, spread and interactions of entomopathogenic fungi and soil-inhabiting microorganisms could therefore provide important information for proper risk assessment of plant protection products which are based on entomopathogenic fungi. For this reason, the influence of the entomopathogenic fungus B. bassiana strain ITCC 4688 on the indigenous fungal diversity of an agricultural field was analysed. During the seven weeks of study B. bassiana became established within the field. In addition, a natural spread, as well as no effect on the diversity of the indigenous soil fungi was detected.
As previously mentioned, in recent years additional different Otiorhynchus species have caused damage to numerous crops which are grown for horticultural purposes worldwide. The increasing extension of their geographic range is probably caused by climate change and/or an intensified international trade of infested plants. Several Otiorhynchus species are extremely polyphagous, have the potential to adapt to new host plants and reproduce by parthenogenesis. Those abilities may favour the establishment of an Otiorhynchus species in a newly colonised habitat. The genetic equipment of the weevils or the association with endosymbiotic bacteria may be responsible for the potential to adapt to new host plants or the parthenogenetic mode of reproduction. Therefore the endosymbiotical spectrum of four Otiorhynchus species was investigated. As one of the results, bacteria of the genera Rickettsia and ?Candidatus Nardonella? were detected. So far, the biological function of bacterial endosymbionts in Otiorhynchus spp. is speculative. However, new insights into the association of bacteria and weevils may be used in future to develop novel strategies for the control of Otiorhynchus pests.
Rüsselkäfer der Gattung Otiorhynchus (Coleoptera: Curculionidae) verursachen durch Wurzelfraß als Larven sowie durch Blattfraß als adulte Tiere weltweit einen wirtschaftlichen Schaden an zahlreichen gartenbaulichen Kulturen. Neben dem bekanntesten Schädling dieser Gattung, dem Gefurchten Dickmaulrüssler Otiorhynchus sulcatus, traten in den vergangenen Jahren diverse andere Otiorhynchus Arten zunehmend als Schaderreger auf. Die nachtaktiven Käfer sowie die bodenbewohnenden Larven sind grundsätzlich schwer mit biologischen oder chemischen Pflanzenschutzmitteln zu bekämpfen. Da jede Otiorhynchus Art unterschiedlich empfindlich gegenüber Pflanzenschutzmitteln reagieren kann sowie ihre eigene Phänologie aufweist, ist die exakte Artbestimmung dieser Schädlinge eine Grundvoraussetzung für die Entwicklung von effektiven Bekämpfungsstrategien. Adulte Rüsselkäfer lassen sich anhand ihrer Morphologie gut bestimmen. Die morphologische Artunterscheidung von Otiorhynchus Eiern, Larven und Puppen ist jedoch nahezu unmöglich. Deshalb wurde im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit ein molekulares Diagnoseverfahren entwickelt, das es ermöglicht 16 Otiorhynchus Arten und acht weitere Rüsselkäferarten, unabhängig von ihrem Entwicklungsstadium, zu bestimmen. Dieses Verfahren kann zukünftig als schnelle und kostengünstige Methode zur sicheren Identifikation von Rüsselkäfern im Pflanzenschutz eingesetzt werden.
Zur biologischen Bekämpfung von O. sulcatus Larven werden in der Praxis häufig entomopathogene Nematoden verwendet. Eine weitere biologische Bekämpfungsmöglichkeit stellen entomopathogene Pilze dar. Bislang wurden sowohl entomopathogene Nematoden als auch Pilze hauptsächlich gegen den Gefurchten Dickmaulrüssler eingesetzt. Über die Wirksamkeit gegenüber anderen Otiorhynchus Arten ist jedoch nur wenig bekannt. Deshalb wurden die entomopathogenen Pilze Beauveria bassiana, Isaria fumosorosea und Metarhizium anisopliae, welche in den kommerziell erhältlichen Präparaten Naturalis®, PreFeRal® WG bzw. GranMet-P® enthalten sind, im Labor gegen unterschiedliche Entwicklungsstadien verschiedener Rüsselkäferarten der Gattung Otiorhynchus getestet. Es konnte gezeigt werden, dass verschiedene Otiorhynchus Arten als adulte Käfer unterschiedlich empfindlich gegenüber den getesteten entomopathogenen Pilzen sind. Außerdem wurde im Freiland eine Methode zur Quantifizierung der Effizienz von entomopathogenen Pilzen gegenüber adulten Käfern der Gattung Otiorhynchus etabliert.
Entomopathogene Pilze, insbesondere die Art B. bassiana, werden weltweit zur biologischen Schädlingsbekämpfung von Insekten eingesetzt. Dabei kann das Kultursubstrat beim Topfen von Pflanzen mit entomopathogenen Pilzen gemischt werden oder die entomopathogenen Pilze werden direkt auf die Pflanze oder auf den Boden ausgebracht. Während die Wirkung von entomopathogenen Pilzen auf Insekten gut untersucht ist, ist bisher nur wenig über deren Persistenz, Verbreitung und Einfluss auf die im Boden natürlich vorkommenden Pilze bekannt. Pilze spielen z. B. als Zersetzer von totem organischem Material oder als Mykorrhiza-Symbionten von Pflanzen eine wichtige Rolle im terrestrischen Ökosystem. Neue Erkenntnisse über die Persistenz, Verbreitung sowie Interaktion von entomopathogenen Pilzen mit den im Boden lebenden Mikroorganismen könnten deshalb wichtige Informationen zur Risikobewertung von biologischen Pflanzenschutzmitteln basierend auf entomopathogenen Pilzen liefern. Aus diesem Grund wurde der Einfluss des entomopathogenen Pilzes B. bassiana Stamm ITCC 4688 auf die indigene Pilzdiversität einer landwirtschaftlich genutzten Ackerfläche untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sich B. bassiana während des Untersuchungszeitraumes von sieben Wochen im Feld etablierte und verbreitete, sowie dass B. bassiana keinen Effekt auf die Diversität der natürlich vorkommenden Pilz-Gemeinschaft hatte.
Wie bereits erwähnt, haben in den letzten Jahren vermehrt verschiedene Rüsselkäferarten der Gattung Otiorhynchus weltweit Schäden an zahlreichen gartenbaulichen Kulturen verursacht. Die zunehmende Ausbreitung der Arten ist wahrscheinlich auf den Klimawandel und/oder auf den verstärkten globalen Handel von befallenen Pflanzen zurückzuführen. Viele Otiorhynchus Arten sind extrem polyphag, besitzen das Potential sich an neue Wirtspflanzen anzupassen und vermehren sich durch Parthenogenese. Diese Fähigkeiten könnten die Etablierung einer Otiorhynchus Art in einem vorher unbesiedelten Gebiet begünstigen. Das Potential, sich an neue Wirtspflanzen anzupassen sowie die parthenogenetische Fortpflanzung könnten sowohl in der genetischen Ausstattung der Käfer als auch in einer Vergesellschaftung mit endosymbiontischen Bakterien begründet sein. Deshalb wurde im Rahmen der vorliegenden Dissertation das Endosymbiontenspektrum von vier verschiedenen Otiorhynchus Arten untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass unter anderem Bakterien der Gattungen Rickettsia sowie ?Candidatus Nardonella? in den untersuchten Käfern vorkamen. Die biologische Funktion dieser Endosymbionten ist bisher spekulativ. Erkenntnisse darüber könnten jedoch zukünftig zur Entwicklung von neuen Bekämpfungsstrategien gegenüber Rüsselkäfern der Gattung Otiorhynchus genutzt werden.
1352383536
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2012/773/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2012/773/pdf/Dissertation_Jacqueline_Hirsch.pdf
Hirsch, Jacqueline
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Zoologie
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2012-11-29T13:12:47Z
ddc:570
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Health enhancing traditional foods in Brazil : an interdisciplinary approach to food and nutritional security
Universität Hohenheim
Ernährungssicherstellung
Brasilien
Life sciences
Food Security
Tocantins, Brazil
Biofunctional properties
Oenocarpus bacaba
Genipa americana
The Brazilian nutritional profile is currently characterized by the so-called "nutrition transition process" i.e. the population presents nutritional status characteristics of both developing and developed countries. Therefore, malnutrition is present not only in the form of undernutrition but increasingly also presents as overweight and obesity. Some studies suggest that this is not only a particular problem of urban societies but also of rural communities.
Recently, Brazil has impressively advanced on issues which address nutrition, agriculture and health within a sustainable framework. One of the recent initiatives encompasses the Brazilian Food and Nutrition Security Policy, which could be considered as the vanguard of this theme by covering different dimensions of nutritional issues, as defined hereunder: ?Food and Nutrition Security is the achievement of the right of all people to access food regularly and permanently, with quality and enough quantity, without compromising the access to other basic needs, based on food practices to promote health, with respect to cultural differences and being social, economic and environmentally sustainable?.
Since the Brazilian Food and Nutritional Policy is characterized by a broad view on food and nutrition, different components related to food and nutrition have to be considered. Therefore, the health side of the food, in a pluralistic vision has to be taken into account. Thus, food and their consumers are unavoidably connected.
Beyond classical nutrients, much attention has recently been focused on bioactive compounds and their preventive role on non-communicable diseases such as diabetes, cardiovascular diseases and cancer. Therefore researchers are increasingly interested to unfold the preventive biochemical processes of these compounds.
Hence, the current research aimed to investigate health enhancing properties of traditional Brazilian fruits within the Food and Nutrition Security definition of the country. Given the interdisciplinary feature of the topic Food and Nutrition Security, the work was performed in two stages. The first one encompasses a nutritional survey with two rural communities in APA ? Cantão, Tocantins State, Brazil and the second part comprises experimental laboratory research.
The outcome from the nutrition survey showed a high level of food insecurity among the families (84.2%). The nutritional profile of the study population expressed a high prevalence of overweight for the adults (53.7%). Regression analysis showed that the high Body Mass Index (BMI) is influenced by the consumption of an imbalanced diet and the physical activity level. Furthermore, women had a higher prevalence of overweight and obesity in comparison to men. Another observation is that rural communities have a monotonous diet with very low consumption of fruits and vegetables. Besides the negative effect on their body composition, this last result points to the risk of developing micronutrient deficiencies, i.e. hidden hunger. Based on the outcome and the demand presented by the participants in the nutrition survey, two fruits available in the region were chosen to investigate their possible biofunctional properties.
Different assays were performed with Bacaba (Oenocarpus bacaba Mart.) and Jenipapo (Genipa americana L.) phenolic extracts. Extracts from both fruits showed antioxidant and antiproliferative capacities. Since bacaba displayed higher activities than Jenipapo, this fruit was chosen for a more detailed investigation of the biochemical mechanisms involved. The results showed that bacaba phenolic extracts induced apoptosis in MCF-7 breast cancer cells through the mitochondrial pathway. Caspase-6, -8 and -9 were activated when compared to the untreated control in a dose dependent manner (p<.05). However, caspase-9 showed the highest activation. Since MCF-7 cells do not express caspase-3 and based on additional investigations on PARP (Poly (ADP-ribose) polymerase) - cleavage, the experiments suggest that caspase-9 plays an important role in the observed apoptotic effect. The laboratory work thus emphasizes the potential healthy properties of traditional fruits from the Brazilian biodiversity with high antioxidant activities.
Altogether, the results indicate the need of a better nutritional education with the involved communities in order to promote healthy eating practices and to increase the consumption of fruit and vegetables. Based on this, it is suggested for government and policy makers to take action in rural communities.
Indeed, it is undeniable that the biodiversity available in Brazil is a huge treasure and source of novel ?superfruits?. Therefore, the current work reinforces the development of research in this area in order of identify health enhancing neglected traditional fruits and to promote their consumption, add value and generate income to small farmers and traditional communities with not only the improvement of their economic power, but also of their diets and health respecting their tradition and culture. Not to mention the contribution to biodiversity preservation since plants that were merely discarded could now have a multifactor value in line with the Brazilian Food and Nutritional Security policy.
Derzeit ist das brazilianische Ernährungsprofil vom so genannten ?nutrition transition process? geprägt, das heißt, die Landbevölkerung weist Ernährungscharakteristika von Industrie- und Entwicklungsländern auf. Deshalb ist Fehlernährung in Brazilien nicht nur als Unterernährung vorzufinden, sondern auch in Form von Übergewicht und Adipositas. Manche Studien belegen, dass dies nicht nur ein Problem in Städten sondern auch inländlichen Gebieten ist.
In letzter Zeit hat sich Brasilien in eindrucksvoller Weise auf verschiedenen Gebieten wie z.B. Ernährung, Landwirtschaft und Gesundheit weiterentwickelt und diese in ein Nachhaltigkeitskonzept integriert. Eine der neuesten Initiativen ist die brasilianische Nahrungs- und Ernährungssicherheitsstrategie. Die Grundidee der Initiative ist Vorreiter in diesem Themengebiet, indem sie verschiedene Dimensionen von Ernährungsfragen verbindet und sind wie folgt definiert: ?Die Nahrungs- und Ernährungssicherheit ist das Erreichen des Rechts aller Menschen, regelmäßigen und permanenten Zugang zu qualitativ hochwertiger Nahrung in ausreichender Menge zu haben, ohne Gefährdung anderer grundlegender menschlicher Bedürfnisse, basierend auf Ernährungsweisen, die unter Einbeziehung kultureller Hintergründe und unter Berücksichtigung sozialer, ökonomischer und ökologischer Faktoren die Gesundheit fördern?.
Die brasilianische Nahrungs- und Ernährungsinitiative beinhaltet eine holistische Betrachtung von Lebensmittel und Ernährung. Aus diesem Grund müssen verschiedene Aspekte, die mit Lebensmitteln und Ernährung zu tun haben, ganzheitlich gesehen werden. Daraus folgt, dass Nahrung und ihre Konsumenten unvermeidbar miteinander verbunden sind.
In der Wissenschaft wird derzeit bioaktiven Substanzen und ihrer präventiven Rolle bei nicht übertragbaren Krankheiten, wie z.B. Diabetes, Herz-Kreislauferkrankungen und Krebserkrankungen, viel Aufmerksamkeit geschenkt. Deshalb steigt das Interesse der Wissenschaftler, diesen Vorgang auf biochemischer Ebene zu entschlüsseln.
Aus diesem Grund war es Ziel der vorliegenden Arbeit, die gesundheitsfördernden Eigenschaften von traditionellen brasilianischen Früchten auf Basis der Nahrungs- und Ernährungssicherheitsinitiative Brasiliens zu untersuchen. Da dieses Konzept interdisziplinäre Aspekte aufweist, wurde die Studie in zwei Abschnitten durchgeführt. Im ersten Teil wurde in zwei ländlichen Gebieten des APA-Cantão, Tocantins State, Brasilien, eine Ernährungserhebung durchgeführt. Der zweite Teil beinhalte die Untersuchung von traditionellen brasilianischen Früchten im Labor.
Die Fragebögen zur Ernährungssituation zeigten, dass bei den 84,2% der Familien eine große Ernährungsunsicherheit herrscht. Der Ernährungsstatus der befragten Bevölkerungsgruppe weist darauf hin, dass es eine sehr hohe Prävalenz (53,7%) von Übergewicht bei den Erwachsenen existiert. Des Weiteren bestätigte die Regressionsanalyse, dass ein hoher Body Mass Index (BMI) von Faktoren wie z.B. einer unausgewogenen Ernährung und dem Grad der körperlichen Aktivität beeinflusst wird. Darüber hinaus zeigten die Frauen im Vergleich zu den Männern eine höhere Prävalenz für Übergewicht und Adipositas. Zusätzlich wurde beobachtet, dass im ländlichen Gebiet die Bevölkerung eine recht einseitige Ernährungsweise aufweist und Früchte sowie auch Gemüse sehr wenig konsumiert werden. Neben den Einflüssen auf den Körperbau zeigt dieses Ergebnis eine hohe Gefahr des Risikos für Mikronährstoffmangel (versteckter Hunger), auf. Auf Grundlage der Ergebnisse und Wunsch der Teilnehmer der Studie wurden zwei Früchte aus der Region ausgewählt, um sie auf potentiell biofunktionelle Eigenschaften hin zu untersuchen.
Verschiedene biochemische Assays wurden mit phenolischen Extrakten aus Bacaba (Oenocarpus bacaba Mart.) und Jenipapo (Genipa americana L.) durchgeführt. Beide Fruchtextrakte zeigten sehr hohe antioxidative und antiproliferative Eigenschaften. Da Bacaba eine höhere Aktivität aufwies als Jenipapo, wurde es für die weiteren Experimente ausgewählt. Die antioxidative Aktivität vom Bacaba-Extrakt wurde an der MCF-7 Brustkrebs-Zelllinie untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass der phenolischen Extrakt aus Bacaba eine pro-apoptotische Wirkung aufwies, die durch eine Aktivierung des mitochondrialen Signalweges zu erklären ist. Im Gegensatz zur Kontrollprobe hatte Bacaba eine dosis-abhängige Wirkung auf die Aktivierung von den Caspasen -6, -8, und -9. Caspase-9 zeigte dabei die höchste Aktivierung. Die Tatsache, dass MCF-7 Zellen nicht Caspase-3 exprimieren und die Ergebnisse weiterer Untersuchungen an der PARP (poly(ADP-ribose)-Polymerase ) -Spaltung deuten darauf hin, dass Caspase-9 eine wichtige Rolle bei der Apoptose spielt. Insgesamt unterstreichen die Laborergebnisse die potentiellen gesundheitsfördernden Eigenschaften und hohen antioxidativen Wirkungen der traditionellen Früchte aus Brasilien.
Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass es wichtig ist, den beteiligten Dörfern Ernährungsbildung anzubieten, um gesunde Ernährungsweisen und einen höheren Konsum von Früchten und Gemüse zu fördern. Darauf basierend sollten die Regierung und die Gesetzgeber neue Inititativen zur Förderung einer gesunden Ernährung in den ländlichen Gebieten initiieren.
Es ist unbestreitbar, dass die verfügbare Artenvielfalt eine der größte Schätze Brasiliens ist und eine Quelle vieler neuer ?Superfrüchte?. In dieser Arbeit wurde gezeigt, wie wichtig es ist, die Forschung in diesem Bereich mit dem Ziel zu intensivieren, um vernachlässigte Früchte mit gesundheitsfördernden Eigenschaften zu identifizieren und ihren Verzehr zu fördern. Dies würde neben der Möglichkeit für Kleinbauern und traditionelle Gemeinschaften, zusätzliches Einkommen zu erzielen, auch unter Berücksichtigung der Tradition und Kultur die Ernährungsweise und Gesundheit fördern. Doch nicht nur der wirtschaftliche Vorteil, sondern auch der Erhalt der biologischen Vielfalt im brasilianischen Regenwald wäre gewährleistet, womit diese Früchte, gemäß der neuen brasilianischen Nahrungs- und Ernährungssicherheitsinitiative, einen multifaktoriellen Wert für die Menschen dieser Gebiete aufweisen würden.
1354191167
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2012/780/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2012/780/pdf/Diss_Fernanda_Abadio_Finco.pdf
Abadio Finco, Fernanda
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Biologische Chemie und Ernährungswissenschaft
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2012-12-17T09:43:30Z
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Membraneinbau von MscL und MscL-Mutanten aus Escherichia coli
Membrane insertion of MscL and MscL mutants in Escherichia coli
Universität Hohenheim
Transportsystem
Derivatisierung
Life sciences
Membraninsertion
MscL
YidC
SecYEG
membrane insertion
MscL
YidC
SecYEG
Etwa ein Drittel aller in der Zelle synthetisierten Proteine sind Membranproteine. Um ihre Funktion zu erfüllen, muss gewährleistet werden, dass sie ihren Zielort sicher erreichen, effizient in die Membran inserieren und dort ihre korrekte Tertiärstruktur annehmen. Intensive Studien haben gezeigt, dass in Escherichia coli verschiedene Faktoren für die Zielsteuerung und Insertion von Membranproteinen verantwortlich sind und diese als individuelle Module agieren.
Der mechanosensitive Kanal MscL ist ein pentamerer Komplex in der Cytoplasmamembran von E. coli. Als Überdruckventil stellt MscL die Anpassung, der bei unterschiedlichen Umweltbedingungen lebenden Bakterien, an hypoosmotische Stresssituationen sicher. Die zwei Transmembranbereiche des MscL-Monomers sind durch einen periplasmatischen Loop mit einer Länge von 29 Aminosäuren miteinander verbunden. Zunächst wurde der Membraneinbau von MscL anhand von Depletionsstämmen in vivo untersucht (Facey et al., 2007). Durch Derivatisierung eines im periplasmatischen Bereich des MscL-Proteins befindlichen Cysteinrests konnte die Membraninsertion verfolgt werden. Die cotranslationale Zielsteuerung von MscL an die Innenmembran wird über das Signal recognition particle (SRP) vermittelt. Dort inseriert das MscL-Protein unabhängig vom Membranpotential und den Komponenten der Sec-Translokase SecAYEG, YidC ist jedoch für den Insertionsprozess essentiell.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit den molekularen Mechanismen, die der Entscheidung zugrunde liegen, ob die naszierende Polypeptidkette des MscL-Proteins von YidC oder von der Sec-Translokase erkannt und gebunden wird. Zu diesem Zweck wurde der im Periplasma lokalisierte Loop von MscL durch Einfügen negativer oder positiver Ladungen sowie neutraler Aminosäuren verändert und die Auswirkungen auf die Insertion untersucht. Durch Verlängerung des periplasmatischen Bereichs um eine, zwei oder drei negative Ladungen (Aspartatreste) wurde die Insertion von MscL vom Membranpotential und der Sec-Translokase abhängig. Mit jeder zusätzlichen Ladung nahm auch die Abhängigkeit von SecYE zu. Für eine effiziente Translokation des Loops mit drei zusätzlichen, neutralen Aminosäuren (Asparagine) war der Sec-Komplex ebenfalls erforderlich. Für die Insertion dieser MscL-Mutanten war SecA nicht notwendig, jedoch waren alle analysierten MscL-Proteine weiterhin strikt YidC-abhängig. Die Fähigkeit dieser veränderten MscL-Proteine funktionelle Pentamere zu bilden, wurde anhand von Wachstumsversuchen und nativer Gelelektrophorese bestätigt. Die Anwesenheit von drei zusätzlichen positiven Argininen sowie von fünf zusätzlichen negativen Aspartaten im periplasmatischen Loop von MscL verhinderte den Einbau in die Lipidschicht. Als logische Konsequenz konnte die Expression dieser beiden MscL-Proteine in Wachstumsversuchen auch keinen Schutz vor osmotisch bedingter Lyse gewährleisten.
Eine direkte Interaktion von MscL und den funktionellen MscL-Mutanten mit der Membraninsertase YidC wurde durch in vivo Quervernetzungsexperimente verifiziert. Dabei interagiert YidC mit beiden Transmembranbereichen von MscL. Die Kontaktstellen in YidC entsprachen den bereits für Pf3 coat gezeigten Positionen im zentralen Bereich der Membran. Neben der Bedeutung von YidC für eine effiziente Membraninsertion konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die Oligomerisierung von MscL zu einem funktionellen Kanal ebenfalls nur in Anwesenheit von YidC stattfindet.
About one third of all synthesized proteins in a cell are membrane proteins. To accomplish their function, it is important to ensure, that they safely reach their destination, insert efficiently into the membrane, where they fold into their correct tertiary structure. Previous studies have shown that various molecules are responsible for the targeting and insertion of membrane proteins in Escherichia coli that operate as individual modules.
The mechanosensitive channel MscL is a pentameric complex in the cytoplasmic membrane of E. coli. By its action as a safety valve, MscL allows the adaption to hypoosmotic conditions of bacteria living under varying circumstances. The two transmembrane segments of the MscL monomer are connected by a periplasmic loop of 29 amino acid residues. In previous studies, the membrane insertion of MscL was analyzed in vivo in depletion strains and was monitored by modification of a single cysteine residue in the periplasmic domain of the MscL protein (Facey et al., 2007). The targeting of MscL to the inner membrane occurs in a cotranslational manner via the signal recognition particle (SRP). At the membrane, the MscL protein inserts independently of the membrane potential and the Sec-components SecAYEG, but requires YidC for the insertion process.
The present thesis is about the molecular mechanisms regarding the decision whether the nascent polypeptide chain of MscL is recognized and bound by YidC or by the Sec-translocase. The periplasmic localized loop of MscL was altered by introducing negatively or positively charged residues as well as uncharged side chains and the effects on the translocation were investigated. Translocation of the periplasmic domain of MscL was detected using AMS-derivatization (4-acetamido-4´-maleimidylstilbene-2, 2´-disulfonic acid) of a single cysteine residue. The extension of the loop region by one, two or three negatively charged residues (aspartic acid residues) made the insertion of MscL dependent on the membrane potential and the Sec translocon. The requirement of SecYE was gradually affected by increasing the number of charged residues. Efficient translocation of the periplasmic loop with three additional uncharged (asparagines) residues also required the Sec-complex. The insertion of these MscL mutants was independent on the SecA component, but all the investigated mutants still showed a strict dependence on YidC. The ability of the altered MscL proteins to form functional pentameric channels was verified by growth tests and native gel electrophoresis. The presence of three additional positively charged arginine residues in the periplasmic domain inhibited MscL insertion into the lipid bilayer as well as the mutant with five additional negatively charged aspartic acid residues. As a logical consequence, the expression of these two MscL proteins could not protect the cells from osmolysis within growth tests.
The direct involvement of the membrane insertase YidC with MscL and the MscL mutants was corroborated with in vivo crosslinking. YidC interacts with both transmembrane regions of MscL. Earlier studies have shown that YidC makes contact with the Pf3 coat protein in the center of the membrane. Here, the same interaction sites of YidC were identified contacting MscL during its insertion. Besides considering the significance of YidC for efficient membrane insertion, the present work has demonstrated that YidC is also essential for oligomerization of MscL into a functional channel.
1355733810
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2012/787/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2012/787/pdf/Diss_Stella_Neugebauer.pdf
Neugebauer, Stella
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Mikrobiologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:788
2012-12-17T10:32:17Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-7883
Interaktion des Portalring-Proteins gp20 des Bakteriophagen T4 mit Wirtsproteinen von Escherichia coli
Interaction of the portal protein gp20 of bacteriophage T4 with host proteins of Escherichia coli
Universität Hohenheim
T-Phagen
Life sciences
Protein-Protein-Interaktion
Infektion
Virionmorphogenese
Vorkopf
gp20
protein-protein-interaction
infection
virion assembly
prohead
gp20
Der Bakteriophage T4 setzt sich aus den drei strukturellen Untereinheiten Kapsid, Schwanz und Schwanzfibern zusammen und gehört aufgrund seiner kontrahierbaren Schwanzhülle zu den komplexen Myoviridae. Eine Besonderheit im Phagenreich stellt die Membran-assoziierte Kapsidmorphogenese während einer T4-Infektion von E. coli dar. Hierbei bildet sich ausgehend von den beiden Proteinen gp20, dem Portalring-Protein des Phagen T4, und dem Phagen-eigenen Chaperon gp40 ein Membran-gebundener Komplex. Eine Beteiligung bakterieller Proteine wurde vermutet. Dieser Komplex dient als Startpunkt für die weitere Kapsidmorphogenese, die durch die Bildung einer Kern- und Gerüststruktur zu reifen Kapsiden führt, die anschließend im Cytoplasma mit DNA gefüllt werden.
Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Rolle und Funktion des Portalring-Proteins gp20 sowie seine Interaktionen mit zellulären Proteinen genauer analysiert. Hierzu wurde gp20 mit einem His-Tag versehen, wodurch eine Protein-Reinigung mittels Nickel-Affinitätschromatographie möglich war. Durch die nachfolgende Quervernetzung mit Formaldehyd wurden Wechselwirkungen zwischen His-gp20 und den zellulären Chaperonen DnaK, GroEL, Tig und YidC sowie dem Phagen-eigenen Chaperon gp40 nachgewiesen. Lokalisationsstudien mit gp20-GFP sowie mit wildtypischem gp20 bestätigten den Einfluss von YidC und DnaK auf die Membran-Assoziation des Portalring-Proteins. Die Phagenvermehrung wurde durch YidC-Depletion nicht beeinflusst, wohingegen der Verlust von DnaK zu einer verminderten Vermehrung führte. Vorkopf-Strukturen, die eine Zwischenstufe der vollständigen Kapsidmorphogenese darstellen, konnten mit Hilfe einer Phagenmutante in YidC-freien E. coli-Zellen nicht-membrangebunden isoliert werden.
Frühere Studien hatten zur Isolierung verschiedener Ambermutanten geführt. Die Mutante Amber20E481 wurde in der vorliegenden Arbeit verwendet, um die Kapsidmorphogenese genauer zu untersuchen. Es zeigte sich, dass es bei einer nicht-permissiven Infektion zur Synthese einer um 14 Aminosäuren verkürzten gp20-Variante kommt. Obwohl sich das entsprechende Protein, gp20s, in Lokalisations- und Expressionsstudien wie wildtypisches gp20 verhält, ist die Kapsidmorphogenese blockiert. Die überexprimierte und mit einem His-Tag versehene Variante His-gp20s konnte wie das wildtypische gp20 mit YidC, GroEL und gp40 quervernetzt werden. Strukturelle Analysen am Transmissionselektronenmikroskop ergaben, dass die reifen Vorköpfe nicht mit Phagen-DNA gefüllt waren. Wahrscheinlich ist hierfür eine Fehlfunktion bei der DNA-Verpackung verantwortlich.
Bacteriophage T4 is composed of the three structural subunits i. e. capsid, tail and tail fibres. Because of its contractible tail T4 is a member of the Myoviridae. A characteristic feature of its morphogenesis is the membrane-associated assembly of the head structure during a wild-type infection of E. coli. The portal protein, gp20, and the phage-chaperone gp40 are used to form a membrane-bound complex. Most likely, also proteins from the phage-host E. coli are involved in this process. This complex is the starting point for the assembly of the head-related core and scaffold structure. The mature head detaches from the membrane and is filled with DNA thereafter.
In the context of this doctoral thesis the role and function of the portal protein gp20 and its interactions with cellular proteins was analyzed. A His-tag was fused to gp20 and it was purified by nickel-affinity chromatography. Also, interactions with the cellular chaperones DnaK, GroEL, Tig and YidC and the phage-chaperone gp40 were detected after formaldehyde crosslinking. Further studies of the cellular localization showed that gp20 and the fusion protein gp20-GFP are membrane-bound. The importance of YidC and DnaK for this membrane-association was demonstrated by fluorescence microscopy. Phage propagation was not affected by YidC depletion, whereas the loss of DnaK led to a reduced propagation. Prohead-structures, that are an intermediate stage of the capsid assembly, were isolated in YidC-free E. coli-cells membrane-unbound when infected with a phage mutant.
Previous studies had led to the isolation of different amber mutants. Mutant amber20E481 was used in this thesis to analyze the assembly process in more detail. Here, under non-permissive conditions a 14 amino acid shortened protein, gp20s, is synthesized. Despite the fact that the capsid assembly is blocked in the non-suppressor strain, the localization and expression of the truncated protein was comparable to the wild type gp20. Overexpressed and His-tagged gp20s was found to crosslink with YidC, GroEL and gp40. Structural studies with a transmission electron microscope showed, that mature proheads were found and these were not filled with phage DNA. Most probably, a malfunction of gp20s during DNA packaging accounts for this.
1355736737
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2012/788/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2012/788/pdf/Diss_Tobias_Quinten.pdf
Quinten, Tobias
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Mikrobiologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:786
2012-12-17T12:15:50Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-7868
Biogenese und Virusassembly des filamentösen Coliphagen M13
Biogenesis and virus assembly of the filamentous coliphage M13
Universität Hohenheim
Bakteriophage M13
Life sciences
Phagensekretion
Phagen-Display
gp9
YidC
gp1/11
Phage secretion
Phage-Display
gp9
gp1/11
YidC
Der Phage M13 ist taxonomisch den Einzelstrang-DNA-Phagen zugeordnet und gehört zur Familie der Inoviridae. Für die Vermehrung verwendet M13 Gram-nega-tive Escherichia coli-Zellen, die F-Pili ausbilden, als Wirt. Durch die Vermehrung wird die Wirtszelle nicht geschädigt. In dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse über die M13-Biogenese erhalten werden, welche den Bereich Infektionsprozess, die Assem-blierung und die Phagensekretion betreffen.
Durch Adsorptionsexperimente, in denen das Wirtsbakterium E. coli K38 mit M13-Phagen infiziert wurde, konnte gezeigt werden, dass innerhalb der ersten 5 Minuten die Bindung der Phagen an die Zellen stattfindet und hier aufgrund einer Limitierung der F-Pili pro Zelle maximal 7 Phagen pro E. coli-Zelle binden konnten.
Die Insertion des Phagenhüllproteins gp9 in die Zytoplasmamembran der Wirtszelle wurde mit Hilfe antigener Epitope in der N-terminalen Domäne nachgewiesen und es konnte gezeigt werden, dass das YidC-Protein von E. coli dafür benötigt wird.
Zudem wurde gezeigt, dass plasmidkodiertes gp9 mit zusätzlich eingebrachten antigenen Epitopen in der N-terminalen Domäne keinen negativen Effekt auf die Assemblierung neuer Phagen-Nachkommen hatte. Daher kann das gp9 durch die Insertion kurzer Peptidsequenzen (17 ? 36 Aminosäuren) für ein ?Phage-Display? verwendet werden.
Hinsichtlich der Phagenassemblierung war es möglich, den membranständigen gp1/11-Assembly-Komplex, nach Überexpression in E. coli und Größenausschluß-chromatographie, zu charakterisieren und ihm ein Molekulargewicht von ~ 300 kDa zuzuordnen. Die transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Untersuchung des gereinigten gp1/11-Assembly-Komplexes zeigte ringförmige Strukturen mit einem Innendurchmesser von ~ 7 ? 8 nm und einem Außendurchmesser von ~ 11 ? 12 nm.
Die Untersuchung der wildtypischen Phagensekretion zeigte, dass nach einer
5-minütigen Latenzphase (Eklipse) die Sekretion neuer Phagen-Nachkommen erfolgte und eine infizierte E. coli-Zelle in einem Zeitraum von 115 Minuten bis zu 925 neue Phagen sekretieren kann, was einer durchschnittlichen Sekretion von 7 Phagen pro Minute entspricht. Durch die M13-Infektion verlängerte sich die Generationszeit der E. coli K38-Zellen von 24 auf 48 Minuten.
Die Untersuchung der Phagensekretion und der Phagenreplikation genetisch veränderter Phagen, deren Synthese des Haupthüllproteins gp8 durch das Wirts-bakterium mit Hilfe einer Punktmutation im Phagengenom unterbunden wurde, erfolgte in Wirtszellen mit zusätzlich plasmidkodiertem Gen 8 des Phagen. Es zeigte sich, dass das plasmidkodierte gp8 limitiert war, was eine Verringerung der Phagen-sekretion auf ~ 2 Phagen pro Minute verursachte und die Latenzzeit (Eklipse) auf
12 Minuten verzögerte.
Die Sekretion von M13-Phagen aus infizierten E. coli-Zellen konnte mit dem ?Atomic Force Microscope? (AFM) dargestellt und die Phagen am TEM, nach Markierung mit Protein-A konjugiertem Gold, nachgewiesen werden. Die Sekretion von M13-Phagen-Nachkommen begann an den Zellpolen von E. coli und breitete sich im Verlauf von 4 Minuten von diesen zu den Seiten der Zellen hin aus und erstreckte sich nach 16 Minuten über die gesamte Zelloberfläche.
Taxonomically, the bacteriophage M13 is assigned to the single-stranded DNA phage and belongs to the family of Inoviridae. For propagation the Gram-negative bacteria Escherichia coli with F-pili is required. The host cell is not lysed by the phage. New findings about the M13 phage biogenesis are presented here within four essential areas of the M13 phage cycle concerning the sections infection, assembly, and phage secretion.
Phage adsorption experiments in which the host bacterium E. coli K38 was infected by M13 phage showed that the phage adsorption to the cells takes place within the first 5 minutes and because of a limitation of F-pili per cell a maximum of 7 phages per cell were found to be adsorbed.
The insertion of the phage coat protein gp9 into the cytoplasmic membrane of the host cell was verified by the periplasmic location of antigenic epitopes introduced into the N-terminal domain of gp9. The membrane insertion of gp9 was found to depend on the host protein YidC. Plasmid-encoded gp9 exhibiting antigenic epitopes at the N-terminal domain did not interfere with the assembly of new progeny phage. Therefore, the development of a phage display system with gp9 by introducing short peptide sequences (17 ? 36 amino acids) is feasible.
After overexpression of gp1/11 assembly complexes in E. coli and size exclusion chromatography, respectively, the complex was characterized and a molecular weight of ~ 300 kDa was assigned. Examinations of the purified gp1/11 assembly complexes by transmission electron microscopy (TEM) revealed ring-like structures with ~ 7 ? 8 nm in inner diameter and ~ 11 ? 12 nm in outer diameter.
The investigation of M13 wild-type infection showed that the secretion of new progeny phage starts after a short lag period (eclipse). An infected E. coli cell secreted upto 925 progeny in a time period of 115 minutes which corresponds to an average of 7 secreted phages per minute. The generation time of the infected E. coli K38 cells rose from 24 minutes to 48 minutes.
Experiments were carried out with genetically manipulated phages which were hindered to synthesize the major coat protein gp8 in the host cell by a nonsense mutation in the phage genome. Therefore, phage replication was only observed in host cells bearing plasmid encoding gene 8. Since the quantity of the protein was limited the lag period (eclipse) was extended to 12 minutes and the efficiency of phage secretion was decreased to about 2 phages per minute.
The M13 phage secretion from infected E. coli cells was visualized by atomic force microscopy (AFM). The identity of the phage was verified by labeling with protein-A conjugated gold and transmission electron microscopy (TEM). The secretion of M13 progeny was first observed at the cell poles of E. coli and then spreaded within
4 minutes along the cell surface. After 16 minutes the secretion was observed over the entire cell surface.
1355742950
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2012/786/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2012/786/pdf/Diss_Martin_Ploss.pdf
Ploß, Martin
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Mikrobiologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:817
2013-03-14T10:11:35Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-8171
Novel serine phosphorylation sites of IRS2 mediate 14-3-3 binding and regulate insulin signal transduction
Universität Hohenheim
Phosphorylierung
Insulin
Interaktion
Life sciences
IRS2
14-3-3
Phosphorylierung
Insulin
Interaktion
IRS2
14-3-3
phosphorylation
insulin
interaction
Insulin and insulin like growth factor (IGF)-1 mediate their metabolic and mitogenic effects on target tissues through activation of the insulin and IGF-1 receptor. Insulin receptor substrate (IRS) proteins function as intermediate docking platforms to transduce the insulin/IGF-1 signal to intracellular effector molecules that regulate glucose homoeostasis, lipid metabolism, cell proliferation and ß-cell survival. The activated receptors function as tyrosine kinases that phosphorylate IRS proteins on tyrosine residues, thereby generating interaction motifs for Src homology (SH) 2 domain containing proteins. Signal transduction via IRS proteins is furthermore regulated by their serine/threonine phosphorylation by several kinases and this can result in inhibitory or stimulatory consequences for downstream signalling. Hyperphosphorylation of IRS1 has been shown to be involved in the desensitization process that can result in insulin resistance. Both IRS1 and IRS2 undergo proteasomal degradation while particularly IRS2 levels are additionally regulated by cAMP-dependent gene activation.
14-3-3 proteins are versatile regulators of a variety of intracellular processes like control of cell cycle, cell growth, gene transcription and apoptosis. Serine/threonine phosphorylation within distinct motifs on the interaction partner is a prerequisite for 14-3-3 binding. IRS1 and IRS2 have been described as 14-3-3 interaction proteins and interaction of IRS2 with 14-3-3 proteins was specifically characterized in this thesis.
Insulin/IGF-1-dependent PI 3-kinase stimulation as well as elevated cAMP levels were identified to modulate 14-3-3 binding to IRS2. IGF-1 stimulation led to increased binding of 14-3-3 to IRS2 in transfected HEK293 cells and this bind- ing was prevented by inhibition of the PI 3-kinase pathway and an Akt/PKB inhibitor. Insulin-stimulated interaction between endogenous IRS2 and 14-3-3 was observed in rat hepatoma cells and in mice liver after an acute insulin stimulus or refeeding. Application of different IRS2 fragments enabled localization of the IGF-1-dependent 14-3-3 binding region spanning amino acids 300-600. Mass spectrometric analysis produced a total of 24 phosphorylated serine/threonine residues on IRS2 after IGF-1 stimulation with 12 sites unique for IRS2 while the other residues are conserved in IRS1 and IRS2. The 24 identified phosphorylated residues on IRS2 included several 14-3-3 binding candidates in the region 300-600 and single alanine mutants of these candidates led to the identification of Ser573 as 14-3-3 binding site by overlay assays. A phosphosite specific antibody was generated to further characterize Ser573. IGF-1-dependent phosphorylation of Ser573 was reduced by inhibition of PI 3-kinase and Akt/PKB. The alanine mutant of Ser573 showed enhanced phosphorylation of Akt/PKB in an IGF-1 time course experiment. In summary, the data presented in this thesis indicate a negative impact of Ser573 phosphorylation on downstream signalling. Binding of 14-3-3 to IRS2 upon stimulation with forskolin and the cAMP analogue CPT-cAMP (8-(4-chlorophenylthio) adenosine 3?,5?-cyclic monophosphate) was demonstrated in HEK293 cells, that was prevented with the PKA inhibitor H89. The amino acid region behind position 952 on IRS2 was identified as cAMP/PKA-dependent 14-3-3 binding region by GST-14-3-3 pulldown as- says. Mass spectrometric analyses revealed Ser1137/Ser1138 as cAMP-dependent, potential PKA phosphorylation sites. Inhibition of Akt/PKB or ERK did not prevent the cAMP-dependent phosphorylation of IRS2 on PKA consensus motifs. Mutation of Ser1137/Ser1138 to alanine strongly reduced the cAMP-dependent 14-3-3 binding as shown by GST-14-3-3 pulldown experiments and co-immunoprecipitation assays. IRS2 protein degradation was demonstrated by the application of cycloheximide and an increased IRS2 protein stability was observed when HEK293 cells stably expressing IRS2 or primary hepatocytes were incubated with forskolin. This reduced IRS2 protein degradation was dependent on the presence of Ser1137/Ser1138, since stimulation with forskolin did not increase protein stability of the double Ala1137/Ala1138 mutant. To conclude, Ser1137/Ser1138 are presented as novel cAMP-dependent phosphorylation sites on IRS2 and their importance in 14-3-3 binding and IRS2 protein stability is demonstrated. This represents a novel mechanism for the cAMP- dependent upregulation of IRS2 protein levels that can be of importance for hepatic metabolism and ß-cell survival.
Insulin und Insulin like growth factor (IGF)-1 vermitteln ihre metabolischen und mitogenen Effekte in Zielgeweben durch die Aktivierung des Insulin- und des IGF-1-Rezeptors. Die Insulin Rezeptor Substrat (IRS) Proteine fungieren als intermediäre Bindungsstationen, über die das Insulin/IGF-1 Signal an intrazelluläre Effektormoleküle, welche die Glukosehomöostase, den Fettstoffwechsel, das Zellwachstum und das Überleben der ß-Zelle regulieren, weitergeleitet wird. Die Bindung von Insulin/IGF-1 aktiviert die Tyrosinkinaseaktivität des Rezeptors und führt zur Phosphorylierung der IRS Proteine an Tyrosinresten, wodurch Bindungsstellen für Proteine mit einer Src homology (SH) 2 Domäne generiert werden. Phosphorylierung von IRS Proteinen durch zahlreiche Serin/Threoninkinasen kann stimulatorische oder hemmende Auswirkungen auf die nachfolgende Signalkaskade zur Folge haben. Es konnte gezeigt werden dass die Hyperphosphorylierung von IRS1 zur Abschaltung des Insulinsignals beiträgt, was zur Insulinresistenz führen kann. IRS1 und IRS2 werden proteasomal degradiert, wobei vor allem IRS2 zusätzlich durch cAMP-abhängige Genaktivierung reguliert wird.
14-3-3 Proteine regulieren unterschiedliche intrazelluläre Prozesse wie Zellzyklus, Zellwachstum, Gentranskription und Apoptose. Die Serin/Threoninphosphorylierung in konservierten Motiven des Interaktionspartners ist eine Voraussetzung für die Bindung von 14-3-3 Proteinen. IRS1 und IRS2 wurden bereits als 14-3-3 Bindungspartner beschrieben und die Interaktion von IRS2 und 14-3-3 Proteinen wurde in der vorliegenden Dissertation genauer untersucht.
Insulin/IGF-1 Stimulation und erhöhte cAMP-Spiegel konnten als Modulatoren der 14-3-3 Bindung an IRS2 identifiziert werden. IGF-1 Stimulation in transfizierten HEK293 Zellen führte zur Bindung von 14-3-3 an IRS2 wobei diese Bindung durch Inhibierung des PI 3-Kinase Signalweges und einen Akt/PKB-Kinase Inhibitor gehemmt werden konnte. Die Insulin-vermittelte Interaktion von 14-3-3 und endogenem IRS2 konnte in Ratten Hepatomzellen und in Mäuselebern nach akuter Insulinstimulation oder Nahrungsaufnahme beobachtet werden. Durch die Anwendung verschiedener Fragmente des IRS2 Proteins konnte die IGF-1-abhängige 14-3-3 Bindungsregion im IRS2 in den Bereich der Aminosäuren 300 ? 600 lokalisiert werden. Eine massenspektrometrische Analyse ergab 24 phosphorylierte Serin/Threoninreste im IRS2 Protein nach IGF-1 Stimulation, wovon 12 Stellen nur im IRS2 Protein gefunden wurden, während die anderen auch im IRS1 Protein konserviert sind. Unter den 24 identifizierten Phosphorylierungsstellen im IRS2 Protein befanden sich einige Kandidaten in der 14-3-3 Bindungsregion. Die Mutationen der Bindungskandidaten zu Alanin führte zur Identifizierung von Ser573 als 14-3-3 Bindungsstelle und es wurde ein phosphospezifischer Antikörper zur weiteren Charakterisierung der Stelle Ser573 hergestellt. Die Phosphorylierung von Ser573 durch IGF-1 Stimulation war nach Hemmung von PI 3-Kinase und Akt/PKB-Kinase reduziert. Die Alaninmutante von Ser573 zeigte eine verstärkte Phosphorylierung der Akt/PKB-Kinase in einer IGF-1 Zeitreihe. Zusammenfassend deuten die Daten auf einen negativen Einfluss der Phosphorylierung von Ser573 auf die nachfolgende Signalkaskade hin. Bindung von 14-3-3 an IRS2 durch Stimulation mit Forskolin oder dem cAMP Analogon CPT-cAMP (8-(4-chlorophenylthio) adenosin 3?,5?-zyklisches monophosphat) konnte in HEK293 Zellen gezeigt werden. Diese Bindung konnte mit dem PKA Inhibitor H89 gehemmt werden. Mittels GST pulldown Experimenten wurde die cAMP/PKA-abhängige 14-3-3 Bindungsregion in den Bereich der Aminosäuren 952 − 1321 im IRS2 lokalisiert. Eine massenspektrometrische Analyse identifizierte Ser1137/Ser1138 als cAMP-abhängige und potentielle PKA Phosphorylierungsstellen. Eine Hemmung von Akt/PKB-Kinase oder ERK-Kinase konnte die cAMP-abhängige Phosphorylierung von IRS2 an PKA-Konsensusstellen nicht verhindern. Die Mutation von Ser1137/Ser1138 zu Alanin führte zu einer starken Reduzierung der cAMP-abhängigen 14-3-3 Bindung in GST pulldown Experimenten und Ko-Immunpräzipitationen. Die Degradation des IRS2 Proteins wurde durch Cycloheximid sichtbar gemacht und eine erhöhte Stabilität konnte beobachtet werden, wenn HEK293 Zellen die stabil IRS2 exprimierten, oder primäre Hepatozyten mit Forskolin stimuliert wurden. Die reduzierte Proteindegradation war auf die Stellen Ser1137/Ser1138 zurückzuführen, da die Proteinstabilität der Ala1137/Ala1138-Mutante nicht durch Forskolinstimulation erhöht werden konnte. Ser1137/Ser1138 werden in dieser Dissertation als neue cAMP-abhängige IRS2 Phosphorylierungsstellen vorgestellt. Sowohl ihre Bedeutung bei der Interaktion von 14-3-3 und IRS2 als auch bei der IRS2 Proteinstabilität werden dargestellt. Die Ergebnisse deuten auf einen neuen Mechanismus für die cAMP-abhängige Erhöhung der IRS2 Proteinlevel hin, welche für den Metabolismus der Leber und das Überleben der ß-Zelle von Wichtigkeit sein könnte.
1363252295
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2013/817/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2013/817/pdf/Diss_Sabine_Neukamm.pdf
Neukamm, Sabine Sarah
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Biologische Chemie und Ernährungswissenschaft
oai:opus.uni-hohenheim.de:826
2013-03-14T10:56:50Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-8264
Charakterisierung der lichtinduzierten Internalisierung des Ionenkanals TRPL aus Drosophila melanogaster
Characterization of light-dependent internalization of the TRPL ion channel in Drosophila melanogaster
Universität Hohenheim
Ionenkanal
Drosophila
Vesikel
Translokation
Endocytose
Life sciences
Drosophila
Vision
TRP channel
translocation
Die lichtinduzierte Isomerisierung von Rhodopsin in den Komplexaugen von Drosophila führt zur Aktivierung der visuellen Signalkaskade. Der daraus resultierende Kationen-Einstrom durch die beiden Kanäle TRP und TRPL führt letztlich zur Ausbildung eines depolarisierenden Rezeptorpotentials. Darüber hinaus induziert der lichtabhängige Ca2+- Einstrom eine Änderung der subzellulären Lokalisation des TRPL-Kanals. In dunkeladaptierten Fliegen befindet sich der TRPL-Kanal innerhalb der Rhabdomere, während er in helladaptierten Fliegen in einem unbekannten Speicherkompartiment im Zellkörper der Photorezeptorzelle lokalisiert ist. Die lichtabhängige Translokation des TRPL-Kanals ist reversibel. Der Mechanismus dieses lichtinduzierten Transports ist noch weitestgehend ungeklärt, allerdings legen Beobachtungen von vesikulären Strukturen auf immunzytochemischen Schnitten belichteter Fliegen eine Vesikel-vermittelte Endozytose nahe.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Mechanismus der lichtinduzierten Internalisierung des TRPL-Kanals charakterisiert. Anhand immunzytochemischer Studien wurde gezeigt, dass die bei Belichtung gebildeten vesikulären Strukturen nicht nur TRPL sondern darüber hinaus auch Rhodopsin (Rh1) enthalten. Rhodopsin wird wie viele G-Protein-gekoppelte Rezeptoren nach Aktivierung internalisiert. Da bei verschiedenen Wellenlängen unterschiedliche Mengen an aktiviertem Rhodopsin (Metarhodopsin) gebildet werden, hängt die Endozytoserate von Rhodopsin maßgeblich von der Wellenlänge des verwendeten Lichts ab. Um die Endozytoserate von Rh1 aber auch von TRPL quantitativ zu erfassen, wurde die Anzahl der gebildeten Vesikel bei verschiedenen Lichtqualitäten bestimmt. Dabei zeigte sich, dass TRPL bei einer hohen Rh1-Endozytoserate (induziert durch Blaulicht) kaum internalisiert wird, wohingegen Orangebelichtung zu einer starken TRPL-Endozytoserate bei geringer Rh1-Internalisierung führt. Die unterschiedlichen Endozytoseraten von TRPL bei verschiedenen Lichtqualitäten spiegelten sich auch in der Kinetik der TRPL-Translokation wider, was durch die Quantifizierung von Zeitverläufen belegt werden konnte. Diese Ergebnisse legen eine Kompetition zwischen Rh1 und TRPL bezüglich ihrer Internalisierung nahe, deren Ursache in einer Konkurrenz um einen gemeinsamen Internalisierungsfaktor begründet sein könnte.
Durch Analyse der Endozytose in verschiedenen Mutanten konnte überdies gezeigt werden, dass die Endozytose von TRPL zwingend der Aktivierung der Signalkaskade bzw. des damit einhergehenden Ca2+-Einstroms bedarf, während die Internalisierung von Rhodopsin auch in Abwesenheit von Ca2+ erfolgt. Die Internalisierung von Rh1 und TRPL scheint folglich durch unterschiedliche Mechanismen aktiviert zu werden.
Allerdings stellte sich heraus, dass die letztendliche Abschnürung von TRPL-enthaltenden endozytotischen Vesikeln, analog zur Internalisierung von Rh1, ein Dynamin-abhängiger Prozess ist.
Die Endozytose von Rh1 wird durch das monomere G-Protein Rab5 vermittelt. Durch einen Screen
dominant-negativer Rab-Mutanten konnte gezeigt werden, dass die lichtinduzierte Endozytose von TRPL durch die beiden Proteine Rab5 und RabX4 vermittelt wird. Somit stellt die Beteiligung von Rab5 an der Internalisierung beider Proteine eine weitere Gemeinsamkeit dar.
Arrestine spielen bei der Endozytose von Rh1 eine wichtige Rolle. Während Arrestin2 die Inaktivierung des Metarhodopsins vermittelt, leitet Arrestin1 anschließend dessen Internalisierung ein. Dies gilt jedoch nicht für die Internalisierung des TRPL-Kanals. Arrestin2 besitzt im Fall von TRPL jedoch eine wichtige Funktion in Bezug auf dessen Stabilität im Rhabdomer. In der vorliegenden Arbeit wurde durch Analyse verschiedener arr2-Allele belegt, dass der TRPL-Kanal im Dunkeln innerhalb von 10 Tagen vollständig abgebaut wird, während er im Licht stabil bleibt. Folglich vermittelt Arr2 möglicherweise die Verankerung von TRPL im Rhabdomer in Dunkelheit, wohingegen es keine Bedeutung für die Stabilität des im Zellkörper lokalisierten TRPLs besitzt.
Die Internalisierung von Rh1 und TRPL unterscheidet sich auch im Schicksal des internalisierten Proteins. Während endozytiertes Rhodopsin letztendlich einem lysosomalen Abbau unterliegt, wird im Fall des TRPL-Kanals von einem Recylingprozess ausgegangen.
In dieser Arbeit gelang es, Kolokalisationen zwischen TRPL und einem Marker für Recyclingendosomen in helladaptierten Fliegen nachzuweisen, was eine Beteiligung dieser Kompartimente am TRPL-Transport nahelegt. Unter Verwendung eines Lysosomenmarkers gelang es überdies zu demonstrieren, dass internalisiertes TRPL, im Gegensatz zu Rhodopsin1, nicht mit Lysosomen kolokalisiert, was die Existenz eines Recylingprozesses unterstreicht.
The light-dependent isomerization of rhodopsin (Rh1), which takes place in the compound eyes of Drosophila, leads to the activation of the visual signaling cascade. The result is a depolarizing receptor potential caused by the Ca2+-influx through the two cation channels TRP and TRPL. This Ca2+ influx subsequently mediates a change in the subcellular localization of the TRPL channel by inducing its translocation. TRPL of dark-adapted flies is located inside the rhabdomeres, whereas upon illumination, TRPL translocates to a yet unidentified storage compartment in the cell body of the photoreceptor cell. The translocation is reversible; however, the underlying mechanism remains largely unclear. Based on the observation of TRPL-containing vesicles on immunocytochemical sections of illuminated flies a vesicular transport mechanism has been proposed for TRPL translocation.
In the present work, the mechanism underlying light-dependent TRPL internalization was studied. Using immunocytochemical techniques, a co-localization of rhodopsin and TRPL was observed in endocytic vesicles. Like many other G-protein coupled receptors, Rhodopsin undergoes endocytosis following activation. The rate of Rh1 internalization depends on the amount of metarhodopsin and, therefore, on the light quality used for illumination. The internalization rate was determined by counting Rh1- and TRPL-positive vesicles observed upon illumination with different light qualities. Surprisingly, the light quality that induced the highest number of Rh1-positive vesicles (i.e. blue light) caused the lowest number of TRPL-positive vesicles, while illumination with orange light induced strong TRPL internalization, but poor Rh1 endocytosis. Likewise, time courses of TRPL internalization were significantly faster in orange light compared to blue light. These findings may indicate a competition between TRPL and Rh1 for a common internalization factor.
Analysis of endocytosis in different mutants showed that the internalization of TRPL required Ca2+ influx mediated by the activation of the phototransduction cascade, whereas internalization of Rhodopsin was Ca2+-independent. Therefore, the trigger for activating TRPL and Rh1 endocytosis seems to be different, although both types of internalization were mechanistically similar and depended on dynamin function. The internalization of Rhodopsin is mediated by Rab5. A screen of dominant negative Rab mutants revealed that the light-induced internalization of TRPL is mediated by Rab5 and RabX4. Accordingly, the involvement of Rab5 constitutes another common feature in the endocytosis of TRPL and Rh1.
Arrestins play an important role in regulating the endocytosis of rhodopsin. Whereas arrestin2 mediates the inactivation of metarhodopsin, arrestin1 is responsible for subsequent rhodopsin endocytosis. The endocytosis of TRPL is independent of arrestins, but arrestin2 fulfills an important function regarding the stability of the TRPL protein in the rhabdomere. In the present work, the analysis of different arr2 alleles revealed a complete degradation of the TRPL protein after ten days in darkness, but not in light. This finding suggests that arrestin2 has a possible function as a scaffolding protein in the rhabdomer of dark-adapted flies, but not of light-adapted flies, when TRPL is located in a storage compartment in the cell body.
There is another fundamental difference between the two transport mechanisms regarding the fate of the protein after it has been internalized. Rhodopsin undergoes rapid lysosomal degradation whereas the trafficking of TRPL is described as a recycling mechanism. In this work, it was possible to show colocalization of TRPL with recycling endosomes indicating an involvement of these compartments in TRPL trafficking. Furthermore, rhodopsin but not TRPL showed colocalization with a lysosomal marker in light-adapted flies, providing additional evidence for the recycling of the TRPL channel.
1363254956
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2013/826/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2013/826/pdf/Diss_Oberegelsbacher.pdf
Oberegelsbacher, Claudia
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Physiologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:843
2013-05-10T11:29:02Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
urn:nbn:de:bsz:100-opus-8430
Powerful proteins : structure and function of catalytic subunits of electrogenic NADH:quinone oxidoreductases
Universität Hohenheim
NADH-Dehydrogenase <Ubichinon>
Kristallstruktur
Enzymkinetik
Natrium-Wasserstoff-Antiport
Atmungskette
Membranpotenzial
Life sciences
Komplex I
Natrium-Pumpe
NQR
Vibrio cholerae
Complex I
Sodium pump
crystal structure
membrane potentia l, yeast
Electrogenic NADH:quinone oxidoreductases are large, membrane-embedded enzyme complexes found in the respiratory chain of prokaryotes and the mitochondria of eukaryotes. They represent the first module of the oxidative phosphorylation system which converts the energy from nutrients into an electrochemical gradient by coupling redox reactions to the translocation of cations across membranes. A long chain of events, such as the synthesis of ATP, ion homeostasis, reactive oxygen species production and bacterial motility depend on the activity of these complexes.
Complex I consists of up to 45 subunits and can be found in the inner mitochondrial membrane of eukaryotes and in prokaryotes, where it is called NDH I. We investigated the isolated, hydrophobic ND5 subunit, which shows homologies to cation/proton antiporters, from human or Yarrowia lipolytica complex I. In vivo and biochemical analyses provided data on the cation translocation function and the alteration of function by disease-associated mutations. Taken together with the recently published 3D structure of bacterial complex I, these data allowed us to demonstrate that the ND5 subunit could possibly act as an antiporter module of mitochondrial complex I.
Sodium ion translocating NADH:quinone oxidoreductase (Na+-NQR) is an enzyme found in many pathogenic bacteria. It consists of six subunits (NqrA - NqrF) whose 3D structures and enzymatic mechanisms were not known in detail at the time this project was initiated. By using high-resolution X-ray structures and site-directed mutagenesis, combined with biochemical studies, we proposed a model for catalysis and substrate selectivity on the atomic level of the electron input module of the complex, the NADH oxidizing domain of subunit NqrF. Furthermore, we analyzed the binding of silver ions to a cysteine residue in the NADH binding pocket and found that it leads to the inhibition of the Na+-NQR and to the killing of Vibrio cholerae in the nanomolar range. Subunit NqrA forms part of the quinone reductase module. By the use of physicochemical and biochemical methods we identified the herbicide 2,5-dibromo-3-methyl-6-isopropyl-p-benzoquinone (DBMIB) as a quinone antagonist and inhibitor of the Na+-NQR complex and discovered two adjacent quinone binding sites on NqrA.
Elektrogene NADH:Chinon Oxidoreduktasen sind grosse, in die Membran eingebettete Enzym-Komplexe der Atmungskette von Prokaryoten und Eukaryoten. Sie repräsentieren das erste Modul der oxidativen Phosphorylierung, welche die Energie aus Nährstoffen in einen elektrochemischen Gradienten wandelt, indem Redox-Reaktionen an den Transport von Kationen über eine Membran gekoppelt werden. Eine lange Kette an Abläufen in der Zelle hängt von der Aktivität dieser Komplexe ab, so z.B. die Synthese von ATP, Ionen-Homöostase, Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und Motilität von Bakterien.
Komplex I besteht aus bis zu 45 Untereinheiten und findet sich in der inneren Mitochondrienmembran von Eukaryoten und in Prokaryoten, wo er als NDH I bekannt ist. Wir haben die isolierte, hydrophobe ND5 Untereinheit des Komplex I vom Menschen und der Hefe Yarrowia lipolytica untersucht, welche Homologien aufweist zu Kationen/Protonen Antiportern. In vivo und biochemische Analysen ermöglichten die funktionelle Untersuchung der Kationen-Translokation und der Veränderung der Funktion durch Krankheits-assoziierte Mutationen. Zusammen mit der kürzlich publizierten 3D Struktur des bakteriellen Komplex I haben es uns diese Daten erlaubt zu zeigen, dass die ND5 Untereinheit als Antiporter im mitochondriellen Komplex I fungieren könnte.
Die Na+-translozierende NADH:Chinon Oxidoreduktase (Na+-NQR) wird häufig in pathogenen Bakterien vorgefunden. Sie besteht aus sechs Untereinheiten (NqrA - NqrF), deren 3D Struktur und Funktion zu Beginn dieses Projekts nicht im Detail bekannt waren. Durch hochauflösende Röntgen-Kristallstrukturen und ortsgerichtete Mutagenese sowie mittels biochemischen Methoden ist es uns gelungen, auf der atomaren Ebene ein Modell für die Katalyse und die Substratselektivität des Elektroneninput-Moduls, der NADH oxidierenden Domäne der Untereinheit NqrF, zu generieren. Wir haben weiterhin die Bindung von Silberionen an ein Cystein der NADH-Bindetasche analysiert und festgestellt, dass nanomolare Konzentrationen von Ag+ durch diese Bindung zur Hemmung der Na+-NQR und zum Abtöten von Vibrio cholerae führen. Die Untereinheit NqrA bildet einen Teil des Chinon- reduzierenden Moduls. Durch physikochemische und biochemische Untersuchungen konnten wir das Pflanzenschutzmittel 2,5-dibromo-3-methyl-6-isopropyl-p-benzoquinon (DBMIB) als Antagonisten zu Chinon und Inhibitor der Na+-NQR identifizieren, sowie zwei nebeneinanderliegende Chinon-Bindestellen auf NqrA charakterisieren.
1368178142
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2013/843/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2013/843/pdf/Diss_W_Steffen.pdf
Steffen, Wojtek
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Mikrobiologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:872
2013-08-20T10:24:09Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
urn:nbn:de:bsz:100-opus-8724
Interaktion des bakteriellen Quorum Sensing Moleküls N-(3-oxododecanoyl)-L-Homoserin-Lacton (AHL-12) mit humanen neutrophilen Granulozyten
Interaction of the quorum sensing molecule N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine-lactone (AHL-12) with human neutrophil granulocytes
Universität Hohenheim
Chemotaxis
Life sciences
Neutrophile Chemotaxis
Quorum Sensing
Acyl Homoserin Lacton
MAPK p38
LSP1
neutrophil chemotaxis
quorum sensing
Acyl homoserine lactone
MAPK p38
LSP1
Um der Immunantwort ihres Wirtes zu entgehen, bilden Pseudomonas aeruginosa sogenannte Biofilme. Während dieses komplexen Vorganges dient ihnen das Quorum Sensing Signalmolekül N-(3-Oxododecanoyl)-L-Homoserin Lacton (AHL-12) zur Kommunikation untereinander. AHL-12 wird jedoch auch von humanen, polymorphkernigen, neutrophilen Granulozyten (PMN) erkannt. Es ist chemotaktisch für PMN und könnte so die Einwanderung der Zellen an den Ort der Infektion bewirken, um dort eingedrungene Mikroorganismen zu bekämpfen.
Ziel dieser Arbeit war es, über verschiedene Ansätze herauszufinden, wie AHL-12 mit neutrophilen Granulozyten interagiert. Dazu sollte in in vitro Experimenten mit primären, humanen PMN zunächst ein AHL-12-induzierter Signalweg bestimmt werden. In einem weiteren Ansatz sollte mithilfe radioaktiv- (3H-AHL-12) und fluoreszenzmarkierter (AHL-12-FITC) AHL-Moleküle untersucht werden, ob AHL-12 an PMN bindet, oder passiv in die Zelle gelangt und ob humane neutrophile Granulozyten einen spezifischen Oberflächenrezeptor für AHL-12 exprimieren.
In dieser Arbeit wurde bestätigt, dass AHL-12 in PMN Chemotaxis induzierte und es konnte gezeigt werden, dass nach Stimulation der PMN mit AHL-12, MAPK-p38 phosphoryliert und somit aktiviert wurde. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass MAPK-p38 die MAPKAP-Kinase 2 (MK2) phosphorylierte, welche dann wiederum das Leukozytenspezifische Protein 1 (LSP1) phosphorylierte und somit aktivierte. Phospho-LSP1 vermittelte letztlich die AHL-12 induzierte Chemotaxis durch Interaktion mit F-Aktin, sowie über Modulation der Integrin-vermittelten Adhärenz. Durch den MAPK-p38 Inhibitor SB203580 konnte die AHL-12 induzierte Chemotaxis inhibiert werden.
Die Frage, ob ein spezifischer eukaryotischer Rezeptor für AHL-12 existiert, konnte nicht abschließend beantwortet werden, da es nicht gelungen war, mit üblichen Methoden, wie Immunpräzipitation und Crosslinking, ein Protein mit Rezeptorfunktion zu isolieren. Die Bindungsstudien mit 3H-AHL-12 und AHL-12-FITC zeigten, dass ein Großteil des AHL-12-FITC an die Zellmembran gebunden hatte, während ein Teil des AHL in die Zellen gelangt war, sodass auch ein intrazellulärer Rezeptor, oder ein intrazelluläres Bindungsprotein wie IQGAP1 mögliche Interaktionspartner für AHL-12 darstellen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass AHL-12 für PMN chemotaktisch ist. Unter der Annahme, dass AHL-12 in einer frühen Phase der Biofilmbildung freigesetzt wird, bevor Bakterien durch die EPS geschützt sind, haben PMN die Chance Bakterien abzutöten und können so dazu beitragen, die Biofilmbildung zu verhindern.
To evade immune-defense mechanisms of the host, Pseudomonas aeruginosa form so called biofilms. To coordinate this complex process, the bacteria communicate via quorum sensing signals, such as N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone (AHL-12). AHL-12 is also recognized by human polymorphonuclear neutrophils (PMN). It is chemotactic for PMN and thus might cause their directed migration to the site of infection in order to eliminate infiltrated microorganisms.
Through different approaches, the aim of this work was to find out in which way AHL-12 interacts with PMN. As a first step, an AHL-12 induced signaling-pathway should be elucidated in in vitro experiments using primary, human PMN. In a further approach using radioactive- (3H-AHL-12) and fluorescence-labeled (AHL-12-FITC) AHL-molecules, the interaction of AHL-12 with PMN should be examined, especially with regard to the expression of a specific receptor for AHL-12 on PMN.
In this work it was confirmed that AHL-12 induced chemotaxis of human PMN. After stimulation of PMN with AHL-12, MAPK-p38 was phosphorylated and hence activated. Furthermore, it was shown that MAPK-p38 phosphorylated MAPKAP-Kinase 2, which in turn phosphorylated and hence activated leukocyte specific protein 1 (LSP1). LSP1 finally affected chemotaxis via binding to F-Actin and by modulating the intensity of integrin-mediated adherence. The AHL-12 induced chemotaxis was inhibited by SB203580, an inhibitor of MAPK-p38.
The question, whether there is a specific receptor for AHL-12 in PMN, could not be answered conclusively, because it was not possible to isolate a protein with receptor function using conventional methods such as immunoprecipitation and crosslinking. In uptake studies with 3H-AHL-12 and AHL-12-FITC, it was shown, that the major portion of AHL-12-FITC bound to the cell membrane. However, another portion got into the cells, which raises the possibility that an intracellular receptor or an intracellular binding protein for AHL-12, for example IQGAP1, exists.
Taken together these data provide evidence that AHL-12 is chemotactic for PMN. Assuming that AHL-12 is released in the early phase of biofilm formation, before bacteria are embedded in the EPS, PMN have the chance to kill bacteria and thus could contribute to prevent biofilm formation.
1376987049
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2013/872/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2013/872/pdf/Doktorarbeit_Nadine_Kahle.pdf
Kahle, Nadine
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Biologische Chemie und Ernährungswissenschaft
oai:opus.uni-hohenheim.de:956
2014-03-24T15:46:48Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-9560
Sensory and consumer-oriented studies on the effect of fat in different food matrices : a comparison between yoghurt, vanilla custard, Lyon-style and liver sausages
Universität Hohenheim
Fett
Joghurt
Milchprodukt
Wurst
Life sciences
Sensorik
Fettreduzierung
Vanillepudding
sensory
fat reduction
vanilla custard
The number of overweight and obese people all over the world increases and overweight and obesity promote the risk for a number of diseases. From the viewpoint of the consumer, it is important to change eating habits and to enhance the extent of physical activity in todays sedentary lifestyles. From the viewpoint of the industry, the amount of fat in foods may be reduced. However, the degree of liking for a food is often related to its fat content because of the various effects of fat on sensory properties. The effect of fat depends on the food matrix and furthermore, consumers expect the presence of different properties as well as different intensities of certain properties depending on the food. Consequently, a detailed sensory approach is needed to successfully develop foods reduced in fat.
Selection of samples for this study based on popularity, on differences in the food matrix as well as on the fact of belonging to the category of meat or rather dairy products, because current data showed that an increased fat intake amongst others arises from an increased consumption of meat and dairy products. Selection resulted in plain stirred yoghurt (0.1 to 12.0% fat) and starch-based vanilla custard (0.1 to 15.8% fat) as well as Lyon-style sausages (3.0 to 25.0% fat) and liver sausages (3.0 to 30.0% fat). Technologies to reduce or rather to substitute fat were adapted to each food matrix, applying innovative approaches. For each food matrix, samples with varying fat content were produced and were evaluated in terms of sensory properties using descriptive analysis, and consumers acceptability using hedonic tests. Afterwards, descriptive and hedonic data were statistically correlated.
Therefore, the present work on the one hand aimed to apply adapted innovative technologies to reduce or rather to substitute fat in different food matrices and to survey their acceptability. On the other hand, the effects of fat and fat reduction on sensory properties and liking as well as the various drivers of liking and disliking were aimed to be examined and contrasted.
Concerning yoghurt, the results showed an increasing effect of fat on attributes creamy (flavor and texture), viscous (appearance and texture) as well as fatty mouth feel. Consumers preferred yoghurts with medium fat (3.5 to 6.0%) and also high fat (12.0%) contents. Liking was driven by attributes sour, aromatic, astringent and partially by descriptors creamy, viscous and fatty mouth feel. Contrariwise, graininess and yellowness as well as too high intensities in attributes creamy, viscous and fatty mouth feel led to rejection. Substituting fat by means of adding whey protein did not enhance liking, but increasing protein did. Finally, the results showed that medium protein contents (4.5%) and high casein-to-whey protein ratios (80/20) could lead to accepted low-fat yoghurts.
Regarding vanilla custard, fat increased intensities in attributes thick (appearance and texture), creamy (flavor and texture), sticky and fatty, whereas yellowness, surface shine, jelly, cooked and vanilla flavor, as well as harmonious were decreased by fat. Low to medium fat custards (1.5 to 8.6%) showed best liking scores and attributes vanilla and cooked flavor, harmonious, vegetable fat flavor, sticky, fatty and creamy texture were found to drive liking. On the opposite, custards high in jelly texture and partially too high in thickness, whiteness and creamy flavor were disliked. The addition of a vegetable fat cream led to well accepted medium fat (2.9%) vanilla custards.
In Lyon-style sausages, fat exerted an increasing effect on attributes meat flavor, aftertaste meat flavor, greasy and juicy, and a decreasing effect on red color intensity, spicy, spicy aftertaste, raspy throat, coarse and firm. Regarding liver sausages, fat increased scores in attributes greasy, creamy texture, lumpy (appearance and texture), foamy, off-flavor and sweet. Contrariwise, it decreased red color intensity, odor attributes spicy, liver and metallic as well as flavor descriptors spicy, liver, aftertaste, peppery, bitter and metallic and also texture properties firm and furred tongue. For both types of sausage, preferences were mainly found for medium fat contents (10.0 and 17.0%), but consumers partially also liked sausages high in fat (25.0 or rather 30.0%) and low in fat (3.0%). No clear drivers of liking could be detected for the sausages. The results showed that the addition of inulin, citrus fiber and partially rice starch led to a successful imitation of fat or rather to acceptable fat-reduced sausages which are furthermore fiber enriched.
The current study gives an interesting overview of the various effects of fat depending on the food matrix. It furthermore gives evidence for the successful development of an assortment of popular fat reduced meat and dairy products.
Die Zahl der übergewichtigen und fettleibigen Menschen auf der ganzen Welt steigt, wobei Übergewicht und Fettleibigkeit das Risiko für zahlreiche Krankheiten fördert. Aus Sicht des Konsumenten ist es wichtig, die Essgewohnheiten zu ändern und den Umfang an körperlicher Aktivität des oftmals bewegungsarmen Lebensstils zu steigern. Aus Sicht der Industrie kann u.a. der Fettgehalt in Lebensmitteln reduziert werden, jedoch ist die Akzeptanz eines Produktes durch die vielfältigen Einflüsse von Fett auf das sensorische Profil meist abhängig von dessen Fettgehalt. Der Einfluss von Fett hängt von der Lebensmittelmatrix ab. Desweiteren erwarten Konsumenten je nach Produkt, das Vorhandensein unterschiedlicher Eigenschaften sowie unterschiedlich stark ausgeprägte Eigenschaften. Für die erfolgreiche Entwicklung fettreduzierter Produkte ist somit eine genaue sensorische Herangehensweise notwendig.
Das Untersuchungsmaterial für diese Arbeit wurde nach dem Aspekt der allgemeinen Beliebtheit sowie nach Unterschieden in der Matrix ausgewählt. Desweiteren wurden die Produkte hinsichtlich ihrer Zugehörigkeit zur Gruppe der Milchprodukte bzw. der Fleischerzeugnisse ausgewählt, da aktuelle Daten zeigen, dass eine erhöhte tägliche Fettzufuhr unter anderem aus einem erhöhtem Verzehr an Milch- und Fleischprodukten resultiert. Es wurden die vier Produkte gerührter Naturjoghurt (0,1 bis 12,0% Fett), Vanillepudding auf Stärkebasis (0,1 bis 15,8% Fett) sowie Lyoner (3,0 bis 25,0% Fett) und Leberwurst (3,0 bis 30,0% Fett) ausgewählt. Um Fett zu reduzieren bzw. zu ersetzen wurden innovative Methoden angewandt, angepasst an die jeweilige Lebensmittelmatrix. Für jede Matrix wurden Proben mit unterschiedlichen Fettgehalten hergestellt und schließlich auf ihre sensorischen Eigenschaften mittels deskriptiver Analyse, sowie Konsumentenakzeptanz mittels hedonischer Tests, untersucht. Schließlich wurden die ermittelten deskriptiven und hedonischen Daten statistisch miteinander verknüpft.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit lag somit zum Einen in der Anwendung innovativer Technologien zur Fettreduktion bzw. Fettsubstitution in unterschiedlichen Lebensmittelmatrices sowie in der Überprüfung ihrer Akzeptanz. Ferner sollte der Einfluss von Fett und Fettreduzierung auf die sensorischen Eigenschaften und die Beliebtheit sowie die entsprechenden Drivers of liking und Drivers of disliking ermittelt und gegenübergestellt werden.
In Naturjoghurt wurde ein steigender Effekt von Fett bezüglich der Attribute cremig, sahnig, viskos (Aussehen und Textur) sowie Fettfilm ermittelt. Konsumenten bevorzugten Joghurts mit mittlerem Fettgehalt (3,5 bis 6,0%) und auch hohem (12,0%) Fettgehalt, wobei die Beliebtheit durch die Attribute sauer, aromatisch und adstringierend sowie zum Teil cremig, sahnig, viskos und Fettfilm gesteigert wurde. Dagegen führten Griessigkeit und gelbe Farbe sowie sehr hohe Intensitäten in den Attributen cremig, sahnig, viskos und Fettfilm zu Ablehnung beim Konsumenten. Fettersatz durch Einsatz von Molkenprotein zeigte keine Verbesserung der Beliebtheit, das Erhöhen des Proteingehalts hingegen schon. Die Ergebnisse zeigten, dass mittlere Proteingehalte (4,5%) und ein hohes Casein/Molkenprotein-Verhältnis (80/20) zur Herstellung akzeptierter, fettarmer Joghurts führen können.
In Vanillepuddings führte ein höherer Fettgehalt zu höheren Intensitäten in den Eigenschaften fest (Aussehen und Textur), cremig, sahnig, klebrig und schmierig, wohingegen niedrigere Intensitäten in den Attributen gelbe Farbe, Glanz, gelatineartig, Koch- und Vanillegeschmack sowie harmonisch ermittelt wurden. Vanillepuddings mit geringem bis mittlerem Fettgehalt (1,5 8,6%) waren am beliebtesten, wobei Konsumenten Puddings mit intensivem Koch-, Vanille- und Pflanzenfettgeschmack bevorzugten, die zudem hohe Intensitäten in den Attributen harmonisch, klebrig, schmierig und cremig besaßen. Dagegen wurden stark gelatineartige Puddings mit teilweise zu intensiver Festigkeit, weißer Farbe und zu sahnigem Geschmack abgelehnt. Die Verwendung einer Pflanzenfettcreme führte zu hoch akzeptierten Vanillepuddings mit mittlerem Fettgehalt (2,9%).
Bezüglich der Lyoner Würste wurde ermittelt, dass Fett die Intensitäten der Attribute Fleischgeschmack, Fleisch-Nachgeschmack, fettig und saftig erhöht, während die Ausprägungen in den Eigenschaften rote Farbintensität, würzig, würziger Nachgeschmack, kratzig, rau und fest durch Fett verringert wurden. In Leberwurst wurden mit steigendem Fettgehalt höhere Intensitäten in den Attributen fettig, cremig, klumpig (Aussehen und Textur), schaumig, Fehlgeschmack und süß beobachtet. Hingegen wurden die Ausprägungen der Deskriptoren Farbintensität, würziger Geruch, Lebergeruch, metallischer Geruch, Lebergeschmack, Nachgeschmack, würzig, pfeffrig, bitter und metallisch sowie fest und pelzig durch Fett verringert. Für beide Wurstarten wurden vorrangig Präferenzen für Proben mit mittlerem Fettgehalt (10,0 und 17,0%) ermittelt, jedoch waren zum Teil auch Würste mit hohem (25,0 oder 30,0%) bzw. niedrigem (3,0%) Fettgehalt beim Konsumenten beliebt. Für beide Wurstarten konnten keine konkreten Drivers of liking und Drivers of disliking ermittelt werden. Die Ergebnisse zeigten, dass der Einsatz von Inulin, Citrusfasern sowie teilweise Reisstärke zu erfolgreicher Imitation von Fett führte bzw., dass vom Konsumenten akzeptierte fettreduzierte Würste hergestellt werden konnten, welche desweiteren mit Ballastoffen angereichert sind.
Die vorliegende Studie gibt einen interessanten Überblick über die zahlreichen Einflüsse von Fett in Abhängigkeit von der Matrix und liefert Hinweise für die Entwicklung ausgewählter beliebter fettreduzierter Milch- und Fleischprodukte.
1395666431
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2014/956/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2014/956/pdf/Dissertation_Tomaschunas.pdf
Tomaschunas, Maja
Universität Hohenheim, Fakultätsübergreifend / Sonstige Einrichtung. Sonstige Einrichtungen
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:992
2014-08-06T16:07:08Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-9920
Stressful environments : motility and catecholamine response in Vibrio cholerae
Universität Hohenheim
Vibrio cholerae
Flagella
Adrenalin
Noradrenalin
Motilität
Life sciences
Vibrio cholerae
Flagella
Epinephrine
Norepinephrine
Motility
The human pathogen Vibrio cholerae is able to inhabit a variety of environments. These include especially aquatic ecosystems, but the human intestine as well. V. cholerae is thus tolerant to a wide range of salinity and pH. Motility is achieved by a sodium driven polar flagellum. The affinity for Na+ to run the flagellum is determined by the stator complex PomAB, which is embedded in the cell membrane within the flagellar motor. A critical aminoacid residue for the binding of Na+ is aspartate 23 within the transmembrane helix of PomB. A mutation of this aminoacid residue leads to an immotile phenotype of V. cholerae.
It was thus of interest to investigate if other polar or acidic aminoacid residues within PomB are important for the passage of Na+. Two potential candidates are serine at position 26 and aspartate at position 42 of PomB, both aminoacid residues are conserved within sodium driven flagellar stator complexes. To characterize the pathway of Na+ through the PomAB channel,
the influence of chloride salts (Na+ and K+) and the pH on the motility of V. cholerae was studied. Motility decreased at elevated pH but increased if a chaotropic chloride salt was added, which excludes a direct Na+ and H+ competition in the process of binding to the conserved PomB D23 residue. Cells expressing the PomB S26A/T or D42N variants lost motility at low Na+ concentrations but regained motility in the presence of 170mM chloride. The swimming speeds of individual cells were also analyzed and revealed that S26 located within the membrane helix of PomB is required to promote very fast swimming of V. cholerae. Loss of hypermotility was observed with the S26T variant of PomB which was partially restored by lowering the pH of the external medium. Modification of PomA and PomB by N,N-dicyclohexylcarbodiimide indicates the presence of protonated carboxyl groups in the hydrophobic regions of the two proteins. Na+ did not protect PomA and PomB from this modification. It could be demonstrated that the motility of V. cholerae is influenced by the pH and osmolality of the medium and thus, the aminoacid residues S26 and D42 together with D23 of PomB have a function in the passage of Na+ into the cell. The H+ rather than the Na+ concentration determines the efficiency of the motor, indicating the presence of a catalytical important hydrogen bond network in the motor channel. It is proposed that D23, S26 and D42 of PomB are part of an ion-conducting pathway formed by the PomAB stator complex.
As mentioned above, V. cholerae is a pathogen which settles the human intestine. As other pathogens are able to respond specifically to the stress associated mammalian hormones epinephrine and norepinephrine it was of an interest to investigate the influence of these hormones on growth and motility of V. cholerae. The response to epinephrine and norepinephrine is mediated by the QseC sensor protein. The genome of V. cholerae comprises a gene which is homolog to qseC from E. coli. Growth and swarming of V. cholerae was enhanced in the presence of 0.1mM epinephrine or norepinephrine. qRT-PCR experiments revealed increased expression of the genes encoding the putative sensor kinase qseC and pomB, a component of the flagellar motor complex under the influence of catecholates. HPLC measurements of bacterial supernatant revealed that norepinephrine is completely degraded or metabolized after 48 h in the presence of V. cholerae, concomitant with the appearance of another, unidentified compound. On the other hand, V. cholerae seemed to stabilize epinephrine. After 48 h, 0.46% of the epinephrine added at the beginning of the growth experiment was retained. Again, a yet unidentified compound was detected. The experiments conducted in this work strongly indicate the presence of a catecholate receptor in V. cholerae.
Das für den Menschen pathogene Bakterium Vibrio cholerae ist in der Lage eine Vielzahl von unterschiedlichen Lebensräumen zu besiedeln. Diese beinhalten vor allem aquatische Ökosysteme, aber auch den menschlichen Dünndarm. V. cholerae ist daher in der Lage sich einem breiten pH Bereich und unterschiedlichen Salzkonzentrationen in der Umgebung anzupassen. Beweglich wird V. cholerae durch den Besitz eines polaren Flagellums, welches durch Na+ angetrieben wird. Die Affinität für Na+ wird festgelegt durch den membranständigen Statorkomplex PomAB, welches innerhalb des Flagellenmotors liegt. Ein wichtiger Aminosäurerest für die Bindung von Na+ ist hierbei das Aspartat 23 in der transmembranen Helix von PomB. Eine Mutation dieser Aminosäure führt zu einem immotilen Phänotyp von V. cholerae.
Es war daher von Interesse, andere polare oder saure Aminosäuren innerhalb von PomB zu untersuchen, die ebenfalls wichtig sein könnten für den Transport von Na+. Zwei mögliche Kandidaten sind hierbei das Serin an Position 26 und das Aspartat an Position 42 von PomB. Beide Aminosäuren sind innerhalb der natriumbetriebenen Statorkomplexe konserviert. Um den Weg des Na+ durch den PomAB Kanal zu charakterisieren, wurde der Einfluss von Chloridsalzen (Na+ und K+) im Medium und der pH des Mediums auf die beweglichkeit von V. cholerae untersucht. Die Beweglichkeit nimmt unter erhöhtem pH ab, nimmt aber wieder zu, wenn chaotrope Chloridsalze dem Medium beigefügt wurde. Dies schließt eine direkte Konkurrenz um die Bindung an dem konservierten D23 in PomB zwischen Na+ und H+ aus. Zellen, die PomB S26A/T oder D42N Varianten exprimieren, waren unbeweglich bei niedrigen Na+ Konzentrationen, erlangten ihre Beweglichkeit wieder durch die Zugabe von 170mM Chlorid. Die Schwimmgeschwindigkeiten einzelner Zellen wurde ebenfalls in dieser Arbeit untersucht. Die Messungen ergaben, dass S26 in der transmembranen Helix von PomB wichtig ist, um sehr schnelle Schwimmgeschwindigkeiten zu erreichen. Hypermotilität in der S26T Variante von PomB konnte teilweise durch das Absenken des pHs im Medium wiedererlangt werden. Die Modifizierung von PomA und PomB durch N,N-dicyclohexylcarbodiimide deutet darauf hin, dass in den hydrophoben Regionen der beiden Proteine, protonierte Carboxylgruppen vorhanden sind. Na+ konnte PomA und PomB nicht vor dieser Modifikation schützen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Beweglichkeit von V. cholerae durch den pH und die Osmolalität des Mediums beinflusst wird. Die Aminosäuren S26 und D42 zusammen mit D23 von PomB spielen eine Rolle im Na+ Transport in die Zelle. Außerdem prägt eher die H+ als die Na+ Konzentration der Umgebung die Effizienz des Motors, was auf ein katalytisch wichtiges Netz aus Wasserstoffbrückenbindungen hindeutet. Es wird postuliert, dass D23, S26 und D42 von PomB beim Transport von Na+ durch den PomAB Kanal eine Rolle spielen.
Wie bereits oben erwähnt, ist V. cholerae in der Lage, den menschlichen Dünndarm zu besiedeln. Es ist bereits bekannt, dass andere pathogene Mikroorganismen in der Lage sind, auf die Stresshormone Adrenalin und Noradrenalin von Säugetieren zu reagieren. Es war daher von Interesse,den Einfluss dieser Hormone auf das Wachstum und die Beweglichkeit von V. cholerae hin zu untersuchen. Das membranständige Sensorprotein QseC erkennt in pathogenen Bakterien die Hormone Adrenalin und Noradrenalin. Und auch V. cholerae besitzt ein Gen, welches homolog ist zu qseC aus E. coli. Das Wachstum und Schwärmverhalten von V. cholerae wurde durch die Zugabe von 0.1mM Adrenalin und Noradrenalin im Medium verstärkt. Außerdem stieg unter Einfluss der Katecholate die Expressionsrate der Gene qseC, welches für eine hypothetische Sensorkinase kodiert und pomB, welches für ein Protein des Flagellenmotors kodiert. Messungen des bakteriellen Überstandes mittels HPLC ergaben, dass nach 48 h Noradrenalin komplett in ein noch nicht näher charakterisiertes Produkt abgebaut oder von V. cholerae metabolisiert wurde. Auf der anderen Seite scheint V. cholerae Adrenalin im Medium zu stabilisieren. Nach 48 h konnte noch 0.46% des zu Beginn der Experimente eingesetzten Adrenalins wiedergefunden werden. Aber auch hier wurde wieder ein noch nicht identifizierter Stoff detektiert. Die Experimente, die in dieser Arbeit durchgeführt wurden, deuten sehr stark darauf hin, dass V. cholerae ein Rezeptor für Katecholate besitzt.
1407329405
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2014/992/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2014/992/pdf/Diss_PHalang.pdf
Halang, Petra
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Mikrobiologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:993
2014-09-09T11:11:45Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-9938
Entwicklung und Validierung schneller und selektiver Verfahren zum Nachweis von Salmonella enterica, Cronobacter spp. und Bacillus cereus in Milcherzeugnissen
Development and validation of fast and selective methods for the detection of Salmonella enterica, Cronobacter spp. and Bacillus cereus in milk products
Universität Hohenheim
Cronobacter sakazakii
Salmonella
Bacillus
Real time quantitative PCR
Milchprodukt
Life sciences
Cronobacter
Salmonella
Bacillus
TaqMan real-time PCR
milk products
Kontaminationen von Lebensmitteln mit Bacillus cereus, Cronobacter spp. und Salmonella enterica sind weltweit für eine große Zahl an Erkrankungen verantwortlich. Daher werden bei Lebensmitteln hohe Ansprüche auf Hygiene und Qualität gelegt. Häufig betroffen sind Milcherzeugnisse, da diese wie z.B. Milch-, Molke- oder Sahnepulver oft als Zutat für andere Lebensmittel verwendet werden. Diese Produkte sollten jedoch generell frei von Krankheitserregern sein, um dadurch die Produktsicherheit erhöhen zu können. Es wird daher eine spezifische, zuverlässige und schnelle Identifizierung der drei pathogenen Mikroorganismen verlangt. In der Regel dauern die bisherigen verwendeten kulturellen Standardverfahren (§ 64 LFGB, ISO/TS 22964) zwischen drei und sechs Tagen. Eine Zeitersparnis zeigen dagegen molekularbiologische Verfahren, wie die Polymerase Kettenreaktion (PCR), besonders die Real-Time PCR liefert einen schnellen und direkten Nachweis der Erreger.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit lag daher in der Entwicklung und Validierung eines molekularbiologischen Verfahrens zum Nachweis von B. cereus, Cronobacter spp. und S. enterica. Eine Diagnose, ob die Lebensmittelprobe den Erreger enthält oder nicht soll innerhalb von 24 Stunden erfolgen. Die Identifizierung der drei Zielorganismen mittels der entwickelten TaqMan Real-Time PCR erfolgte anhand spezifischer genetischer Charakteristika und unter Verwendung einer internen Amplifikationskontrolle, um falsch positive Ergebnisse ausschließen zu können. Für B. cereus wurde das groEL Gen, das für ein Hitzeschockprotein kodiert ausgewählt. Für den Nachweis von Cronobacter spp. diente das ompA Gen und für S. enterica das invA Gen. Beide Gene sind für die Invasion der beiden Pathogene in die menschlichen Epithelzellen des Gehirns und des Darms verantwortlich. Die Adaption der Verfahren an die Lebensmittelmatrix und eine Optimierung der Anreicherungszeit erfolgte mittels künstlicher Kontamination verschiedener Trockenmilchprodukte. Dabei war es möglich 105 KbE/g C. sakazakii und S. Enteritidis Zellen mit einer Anfangskeimzahl von 100 KbE/g in rekonstituierter Säuglingsnahrung nach einer Anreicherungszeit von sechs Stunden nachzuweisen. Zur Simulierung einer natürlichen Kontamination im Labormaßstab wurde pulverförmige Säuglingsnahrung mit C. sakazakii Zellen künstlich kontaminiert, getrocknet und für 4 Wochen gelagert.
Mit der entwickelten TaqMan Real-Time PCR war der Nachweis einer Anfangskeimzahl von 0,01 KbE/g trocken gestresster C. sakazakii Zellen bei einem aw-Wert von 0,22 nach einer Anreicherung über Nacht möglich.
Die entwickelten Real-Time PCR basierenden Verfahren für den Nachweis der drei wichtigen pathogenen Mikroorganismen in Milcherzeugnissen sind schnell, spezifisch und zuverlässig sowie innerhalb von 24 Stunden durchzuführen.
The presence of pathogens is a serious problem in the food industry and contaminations of food with Bacillus cereus, Cronobacter spp. and Salmonella enterica are responsible for a large number of diseases worldwide. Milk products like milk, whey or cream powder are widely used in industry as an ingredient in other foods. Therefore it requires a fast and reliable identification of pathogenic microorganisms. The official methods according to § 64 LFGB or ISO/TS 22964 apply a common scheme of pre-enrichment, selective enrichment, detection and confirmation and take between three and six days.
The aim of this work was the development and validation of a real-time PCR based method, which identifies the existence of the three pathogens in dairy products within 24 hours. The identification of B. cereus, Cronobacter spp. and S. enterica with the developed TaqMan real-time PCR was performed using specific genetic characteristics and an internal amplification control to eliminate false negative results. For B. cereus, the groEL gene, which codes for a heat shock protein, was selected as target. For the detection of Cronobacter spp. the ompA gene and for S. enterica the invA gene was chosen. Both genes are responsible for the invasion of the pathogens in the human epithelial cells. The adaptation of the method to the food matrix and an optimization of the enrichment time were affected by an artificial contamination of various dry dairy products. It was possible to detect 105 cfu/g C. sakazakii and S. Enteritidis cells with an initial concentration of 100 cfu/g in reconstituted powdered infant formula after enrichment of six hours. To simulate a natural contamination, powdered infant formula was contaminated with desiccated C. sakazakii cells in various concentrations and analyzed with the developed real-time PCR method. It was possible to detect an inoculum concentration of 0.01 CFU/g dry stressed C. sakazakii cells at low aw values (0.22).
The new TaqMan real-time PCR is fast, reliable and specific for the clearly detection of the three major pathogenic microorganisms in milk products and was carried out within 24 hours.
1410249264
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2014/993/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2014/993/pdf/Dissertation_Jennifer_Zimmermann.pdf
Zimmermann, Jennifer
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:1008
2014-10-27T13:56:23Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-10087
Escherichia coli O157:H7 und seine Adaption an verschiedene Wachstumsbedingungen in vitro : Untersuchung des intrazellulären Proteoms und Kohlenhydratmetabolismus
Adaption to different growth conditions in vitro of Escherichia coli O157:H7 : an investigation of intracellular proteome and carbonhydrat metabolism
Universität Hohenheim
EHEC
Proteom
Metabolismus
Kohlenhydrate
Aminosäuren
Life sciences
EHEC
proteome
metabolism
carbonhydrate
amino acid
In der vorliegenden Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen Metabolismus und Pathogenität enterohämorrhagischer E. coli-Bakterien während des Wachstums unter verschiedenen Umweltbedingungen in vitro untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass diese Umweltbedingungen sowohl das Proteom als auch das Genom beeinflussten. Experimente mit den Darmmilieu simulierenden Kulturmedien SIEM und SCEM zeigten abweichende Expressionen der Proteine und Gene im Vergleich zum Wachstum im Referenzmedium TSB. Unter anderem konnte eine Abnahme der Motilität und die Bildung von biofilmähnlichen Substanzen beobachtet werden. Unterschiede ließen sich aber auch beim Metabolismus und der Expression von Chaperonen und Stresssystemen beobachten. Ein verstärkter Glucosemetabolismus, gesteigerte Aminosäuresynthese, verstärkte Bildung von Chaperonen und die Repression von vielen stressassoziierten Proteinen, sowie die Ausprägung von Pathogenitätsfaktoren ließen sich beim Wachstum in den Kulturmedien nachweisen. Die Bedingungen in den Versuchsmedien führten beispielsweise zu einer erhöhten Säureresistenz, die den EHEC-Bakterien eine unbeschadete Passage des Intestinaltrakts ermöglicht. Aber auch Virulenzfaktoren wie die Proteine EspP und EspB konnten identifiziert werden. Zudem konnte in SCEM die Sialinsäureesterase Z1466 zusammen mit Shiga Toxin stark exprimiert gefunden werden, welche den EHEC-Bakterien im Intestinaltrakt einen Wachstumsvorteil gegenüber der intestinalen Mikroflora liefern kann. Mit Hilfe der durchgeführten Isotopolog-Profiling-Experimente durch den Kooperationspartner Dr. rer. nat. Wolfgang Eisenreich (München), konnte zudem der Einfluss auf den Glucosemetabolismus und auch die Aminosäuresynthese untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Stressantwort und die Expression von Virulenzfaktoren auch außerhalb des humanen Wirts induziert werden kann. Sie zeigen aber auch die Komplexität der Regulation verschiedenster Vorgänge in der bakteriellen Zelle als Reaktion auf äußere Faktoren.
The aim of this study was to investigate the linkage of metabolism and pathogenicity of EHEC bacteria under certain environmental conditions in vitro. During the investigations the influence of environmental conditions could be shown on the protein as well as on the gene expression level. In experiments using the culturel media SIEM and SCEM compared to TSB as a reference, differential expression of proteins and genes were shown. For example, decreasing motility and the formation of biofilm-like substances were observed. Furthermore, differences in metabolism and expression of chaperons and stress response systems were detected. After culturing EHEC bacteria in experimental media, increased glucose and pyruvate metabolism, increased amino acid biosynthesis, as well as increased chaperon levels were found, in contrast to decreased expression levels of stress associated proteins. The experimental procedure also affected the presence of pathogenicity factors, like EspP and EspB. Notably, the environmental conditions induced the glutamic acid resistance, providing the EHEC bacteria an unhindered passage through the human gastrointestinal tract, especially the acidic environments like the stomach. Additionally, the sialic acid esterase Z1466 along with shiga toxin, was strongly expressed. This could provide an advantage over the intestinal micro flora, in respect of growth. Effects onto glucose metabolism and amino acid biosynthesis were investigated by isotopoloque profiling experiments, prepared thankworthy by Dr. rer. nat. Wolfgang Eisenreich (Munich).
To conclude, stress response and expression of pathogenicity factors could be induced in vitro in the cultural media elected, and without the need of a human host. The experiment also advices the complex regulation of different processes in bacterial cells as response to external factors.
1414414583
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2014/1008/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2014/1008/pdf/Sabrina_Polzin_Dissertation.pdf
Polzin, Sabrina
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:1013
2014-10-27T14:34:26Z
ddc:570
pub-type:8
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Ultraschallbasierte simultane Konzentrationsbestimmung der Komponenten Zucker und Ethanol in wässrigen Fermentationsfluiden
Ultrasound based simultaneous concentration determination of the components sugar and ethanol in aqueous fermentation fluids
Universität Hohenheim
Ultraschall
Fermentation
Konzentrationsmessung
Zucker
Ethanol
Kohlendioxid
Schallgeschwindigkeit
Kompressibilität
Chemometrie
Life sciences
Fermentationsfluide
fermentation fluids
Bei alkoholischen Fermentationsprozessen in wässrigen Lösungen werden verschiedene Zucker (Mono-, Di- und Polysaccharide) über diverse Zwischenschritte in Ethanol und Kohlendioxid umgewandelt. In der industriellen Produktion sind ultraschallbasierte Verfahren zur Analyse der Zusammensetzung des Fermentationsfluides aufgrund ihrer Robustheit, Preisgünstigkeit und der Möglichkeit zur Durchführung von Onlinemessungen vorteilhaft. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden verschiedene auf der Auswertung von Ultraschallparametern beruhende Verfahren zur Simultanbestimmung des Zucker- und Ethanolgehaltes im Fermentationsfluid auch bei Anwesenheit gelöstem Kohlendioxidgas vorgestellt und hinsichtlich der Genauigkeit der Vorhersagewerte miteinander verglichen.
Zunächst wird das Verhalten der Ultraschallkenngrößen Schallgeschwindigkeit und adiabatische Kompressibilität in standardisierten wässrigen Fluiden in Abhängigkeit von der Konzentration der Komponenten Zucker (2 - 16 Massenprozent) und Ethanol (1 6 Massenprozent), dem CO2-Partialdruck (0 3,013E+05 Pa) und der Temperatur (2° 30° C) untersucht. Als Modellsubstanz für den Zuckeranteil dient dabei das Disaccharid Saccharose. Aus dem Datenfeld der Schallgeschwindigkeit werden zwei polynomische Kalibriermodelle für die Zucker- / Ethanolkonzentration mit den Methoden der multiplen linearen Regression (MLR) und der Partial Least Squares (PLS-) Analyse gewonnen. Die minimale erreichbare Standardabweichung der mit dem jeweiligen Modell bestimmten Konzentrationswerte von den Referenzwerten liegt für das mit der MLR-Methode erstellte Modell bei 0,6 Massenprozent für den Zucker- und 0,2 Massenprozent für den Ethanolanteil. Die PLS-Analyse liefert eine Standardabweichung für die Zucker- / Ethanolwerte von 0,36 / 0,13 Massenprozent (Fluide ohne CO2-Anteil) bzw. 0,5 / 0,17 Massenprozent (Fluide mit CO2-Anteil).
Ein weiteres analytisches Verfahren nutzt ein linearisiertes Modell der adiabatischen Kompressibilität und der Dichte zur Zucker- / Ethanolbestimmung. Die Auswertung zweier physikalischer Parameter ergibt bei dieser Methode eine signifikante Steigerung der Modellgüte. Für Fluide ohne CO2-Anteil wird eine minimale Standardabweichung von 0,06 Massenprozent für die Zucker- und 0,07 Massenprozent für die Ethanolkonzentration erreicht. Für CO2-haltige Fluide ergeben sich die entsprechenden Werte zu 0,06 / 0,13 Massenprozent.
At alcoholic fermentation processes in aqueous solutions there are converted various sugars (mono-, di- and polysaccharides) into ethanol and carbon dioxide by diverse intermediate steps. In the industrial production, ultrasound based methods for the analysis of the composition of the fermentation fluid are advantageous due to their robustness, price cheapness and the possibility for the accomplishment of on line measurements. Within the scope of the present work there are presented several methods for the simultaneous determination of the sugar and ethanol content in the fermentation fluid based on the analysis of ultrasound parameters, also at the presence of dissolved carbon dioxide gas, and compared with respect to the accuracy of their predictive values.
Initially there is investigated the behavior of the parameters sound velocity and adiabatic compressibility in standardized aqueous fluids in dependency of the concentration of the components sugar (2 -16 mass percent) and ethanol (1- 6 mass percent), the CO2 partial pressure (0 3,013E+05 Pa) and the temperature (2 30° C). Thereby the disaccharide saccharose acts as a model substance for the sugar fraction. From the data field of the sound velocity two polynomial calibration models for the sugar / ethanol concentration are extracted with the methods of the multiple linear regression (MLR) and the partial least squares (PLS-) analysis. The minimal accessible standard deviation of the concentration values determined by the particular model from the reference values lies for the MLR method at 0,6 mass percent for the sugar and 0,2 mass percent for the ethanol fraction. The PLS-analysis yields a standard deviation for the sugar and ethanol values of 0,36 and 0,13 mass percent respectively (fluids without a CO2 fraction), as well as 0,5 / 0,17 mass percent (fluids including a CO2 fraction).
A further analytic method uses a linearized model of the adiabatic compressibility and the density for the sugar / ethanol determination. The analysis of two physical parameters at this method yields a significant increase of the model quality. For fluids without a CO2 fraction there is reached a minimal standard deviation of 0,06 mass percent for the sugar and 0,07 mass percent for the ethanol concentration. For CO2 containing fluids the corresponding values results to 0,06 / 0,13 mass percent.
1414416765
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2014/1013/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2014/1013/pdf/290914DissertationTSchoeck.pdf
Schöck, Thomas
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:1043
2015-01-27T08:48:25Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-10433
Die Bedeutung von AQUAPORIN INTERACTOR 1 (AQI1) für die Zelltodregulation in Pflanzen
The impact of AQUAPORIN INTERACTOR 1 (AQI1) on cell death regulation in plants
Universität Hohenheim
Wasserstoffperoxid
Zelltod
Life sciences
Aminoacylase 1
Aquaporine
Hypersensitive Abwehrreaktion (HR)
aminoacylase 1
aquaporins
programmed cell death (PCD)
hypersensitive reaction (HR)
hydrogen peroxide
Der programmierte Zelltod (PCD) stellt einen wichtigen Prozess bei der Entwicklung, Seneszenz und Pathogenabwehr von Pflanzen und Tieren dar. Zum Wohle des Gesamtorganismus kommt es zum genetisch regulierten und gezielten Selbstmord einzelner Zellen. Bei Pflanzen ist PCD vor allem im Rahmen der hypersensitiven Abwehrreaktion (HR) von enormer Wichtigkeit. Sie schützen sich vor schädlichen Eindringlingen, indem infizierte Pflanzenzellen durch PCD gezielt getötet werden. So wird eine räumliche Barriere zwischen Wirt und Pathogen geschaffen und die systemische Ausbreitung von biotrophen Pathogenen verhindert. Die Induktion von PCD erfolgt über komplexe Signalwege. Als Signalsubstanzen spielen reaktive Sauerstoffspezies (ROS), vor allem H2O2, eine wesentliche Rolle. Der Transport von H2O2 über Zellmembranen hinweg erfolgt über Aquaporine. Da intrazelluläre H2O2-Konzentrationen darüber entscheiden wie vital eine Zelle ist, ist die räumliche und zeitliche Kontrolle dieses H2O2-Transports unabdingbar. Als potentieller Regulator der Kanalfunktion der Aquaporine wurde das Protein AQUAPORIN INTERACTOR 1 (AQI1) isoliert. Bei AQI1 handelt es sich um ein pflanzliches Protein mit Homologie zu Aminoacylase 1 aus Säugern. Über Aminoacylasen ist bekannt, dass sie die Hydrolyse acylierter Aminosäuren katalysieren. Die physiologische Funktion dieser Enzyme ist bisher jedoch kaum verstanden.
In dieser Arbeit erfolgte erstmals die Charakterisierung einer Aminoacylase (AQI1) aus Pflanzen. Es wurde die physiologische Funktion von AQI1 als Regulator von Aquaporinen, sowie die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen analysiert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass das pflanzliche Protein AQI1, neben der Deacetylierung von Aminosäuren, eine weitere Aufgabe erfüllen kann. Durch Protein-Protein Interaktion nimmt AQI1 Einfluss auf die Kanalaktivität von Aquaporinen. AQI1 kann den H2O2-Einstrom, sowie den H2O-Einstrom durch Aquaporine inhibieren. Dies erfolgt vermutlich in Form einer Blockade der Aquaporinpore. Durch diese Funktion ist AQI1 wesentlich an der Zelltodregulation in Pflanzen beteiligt. Im Zuge der HR kommt es zur vermehrten Akkumulation von AQI1. Dies verhindert den Eintritt toxischer Mengen H2O2 in die Nachbarzellen, um so die lokale Kontrolle des PCD zu gewährleisten. Zudem scheint AQI1 an der Regulation von Seneszenzprozessen beteiligt zu sein. Es konnte gezeigt werden, dass AQI1 einem Altersgradienten folgend, in jungem Blattgewebe stark akkumuliert, wohingegen es in älterem Blattgewebe abgebaut wird. Durch diese altersabhängige Akkumulation könnte AQI1 zur Vitalität von Blättern beitragen, indem es in jungen Blättern den Eintritt zu hoher H2O2-Konzentrationen in die Zellen verhindert.
Programmed cell death (PCD) is an important process during development, senescence and pathogen defence in plants and in animals. It is a genetically regulated and targeted cell suicide of single cells, for benefit of the whole organism. In plants, PCD is of great importance, especially in the course of the hypersensitive response (HR). For protecting themselves against harmful intruders, infected plant cells are directly deposed of by PCD. The developing local lesions act as a barrier between host plant and pathogen. This prevents the systemic expansion of biotrophic pathogens within the whole plant. The induction of PCD involves complex signal transduction pathways. Reactive oxygen species (ROS), in particular H2O2, play an important role as signal molecules during PCD. The transport of H2O2 across cell membranes is conducted by aquaporins. As the vitality of cells depends on intracellular H2O2-levels, a spatiotemporal control of this H2O2-transport is indispensable.
AQUAPORIN INTERACTOR 1 (AQI1) was isolated as a potential regulator of the channel function of aquaporins. AQI1 is a plant protein with sequence homology to the mammal aminoacylase 1. It is known, that aminoacylases catalyse the hydrolysis of acyl-amino acids. However, the physiological function of these enzymes is still unclear.
This study represents the first characterisation of an aminoacylase (AQI1) in plants. The physiological function of AQI1 as a regulator of aquaporins, as well as the underlying molecular mechanisms, have been analysed. In addition to deacetylation of amino acids, a second function of the protein AQI1 was discovered. AQI1 interferes with the channel activity of aquaporins by protein-protein interaction. In this way, AQI1 is able to inhibit the H2O2-, and to a certain extent also the H2O-influx, through aquaporins. Probably, this happens by blocking the aquaporinpore. Due to this function, AQI1 is a major component in cell death regulation in plants. During the hypersensitive response (HR), which is induced as a result of pathogen attack, AQI1 accumulates to high levels to prevent the influx of toxic amounts of H2O2 into neighbouring cells. This ensures a local control of PCD. In addition, AQI1 seems to be involved in regulation of senescence processes. It could be demonstrated, that AQI1 accumulates in a gradient from juvenile to senescent leaves, due to degradation in older tissues. By this age-dependent accumulation, AQI1 could contribute to the vitality of leaves, by preventing the influx of excessive amounts of H2O2 into the cell.
1422344905
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2015/1043/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2015/1043/pdf/Dissertation_2014_Eva_Glink.pdf
Glink, Eva Katharina
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Genetik
oai:opus.uni-hohenheim.de:1051
2015-02-19T08:24:14Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-10512
Charakterisierung der akzessorischen Proteine vom felinen Coronavirus (FCoV) mit monoklonalen Antikörpern
Characterization of accessory proteins of feline coronavirus (FCoV) with monoclonal antibodies
Universität Hohenheim
Coronaviren
Katze
Proteine
Antikörper
Feline infektiöse Peritonitis
Life sciences
FCoV
akzessorische Proteine
monoklonale Antikörper
Feline infectious peritonitis
feline coronavirus
monoclonal antibodies
accessory proteins
Über Expression und Funktionen der akzessorischen Proteine 3a, 3b, 3c, 7a und 7b von FCoVs ist bislang wenig bekannt. Diese Proteine des FIPV Stamms 79-1146 wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht. Die erzielten Ergebnisse sind nachfolgend dargestellt:
1. Die akzessorischen FCoV Proteine 3a, 3c und 7b wurden mit einem C-terminalen His-Tag in E. coli exprimiert. Zudem wurden die Proteine 3a, 3b, 3c, die C-terminale Hälfte von 3c, 7a, 7b sowie 7b ohne die Aminosäuren 1-17 (7bdeltaSS) als Fusionsproteine mit einem N-terminalen GST- und C-terminalen His-Tag exprimiert. Die Reinigung der Fusionsproteine erfolgte über eine Ni2+-Ionen Affinitätschromatographie unter denaturierenden Bedingungen.
2. Die gereinigten 3c- und 7b-Fusionsproteine wurden für die Immunisierung von Mäusen zur Herstellung von mAk verwendet. Es wurden ELISA-Verfahren etabliert, mit denen anti-3c und anti-7b mAk produzierende Hybridome identifiziert wurden.
3. Die Charakterisierung der anti-3c mAk ergab, dass sie Sequenzen im C-terminalen Bereich des Proteins binden. Der Nachweis des 3c-Proteins gelang jedoch weder in einem eukaryotischen induzierbaren Expressionssystem (Tet-on Zelllinie BHKFIPV-3c) noch in FCoV-infizierten Zellen. Die anti-7b mAk detektierten den Bereich von Aminosäure 58-75; beide reagierten mit einem rekombinanten 7b-Fusionsprotein von Serotyp I FCoV.
4. Die Expression des 7b-Proteins in infizierten Zellen wurde im Western Blot bestätigt. Im Bindungsbereich befindet sich eine N-Glykosylierungsstelle. Nach Tunicamycin-Behandlung war das Signal mit den anti-7b mAk deutlich stärker. Das 7b-Protein konnte, ebenfalls nach Tunicamycin-Behandlung, mittels indirekter Immunfluoreszenz im Zytoplasma infizierter Zellen nachgewiesen werden. Das 7b-Protein kolokalisierte teilweise mit dem ER.
5. Das rekombinante 7b-Protein wurde von allen anti-FIPV 79-1146 Seren und dem Aszites detektiert, jedoch nicht von den untersuchten anti-FECV 79-1683 Seren. Die rekombinanten Fusionsproteine 3a, 3b, 3c und 7a konnten mit keinem der untersuchten anti-FCoV Seren nachgewiesen werden.
Little is known about the expression and function of the FCoV accessory proteins 3a, 3b, 3c, 7a and 7b. These proteins of FIPV strain 79-1146 were investigated in the present study. The obtained results are outlined:
1. The accessory FCoV proteins 3a, 3c and 7b were expressed in E. coli with a C-terminal his-tag. Furthermore the proteins 3a, 3b, 3c, the C-terminal half part of 3c, 7a, 7b as well as 7b without the amino acids 1 to 17 (7bdeltaSS) were expressed as fusion proteins with an N-terminal GST-tag and a C-terminal his-tag. The purification of all fusion proteins was performed by Ni2+ ion affinity chromatography under denaturing conditions.
2. To generate monoclonal antibodies the purified fusion proteins 3c and 7b were used for immunization of mice. ELISA screenings were established which enabled the identification of hybridoma cells that produce mabs against 3c and 7b.
3. The characterization of the anti-3c mabs led to the identification of regions in the C-terminus of the protein. The 3c protein could not be detected in an eukaryotic inducible expression system (Tet-on cell line BHKFIPV-3c) and also not in FCoV-infected cells. The anti-7b mabs bound within the region of amino acids 58 to 75 and reacted with a recombinant 7b fusion protein of a serotype I FCoV.
4. The expression of the 7b protein in infected cells was confirmed by western blot. An N-glycosylation site is located within the binding region. After incubation with tunicamycin the signal obtained with the anti-7b mabs was considerably stronger. Again after tunicamycin treatment the 7b protein was detected in the cytoplasm of infected cells by indirect immunofluorescence. The 7b protein colocalized partially with the ER.
5. The recombinant 7b protein was detected with all of the anti-FIPV 79-1146 sera and the ascites, but not with the anti-FECV 79-1683 sera. In contrast the recombinant fusion proteins 3a, 3b, 3c and 7a were not detected with the analyzed anti-FCoV sera.
1424330654
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2015/1051/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2015/1051/pdf/Diss_Tanja_Lemmermeyer.pdf
Lemmermeyer, Tanja
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Genetik
oai:opus.uni-hohenheim.de:1046
2015-02-19T12:25:44Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-10460
Der Einfluss des Osteoblasten- und Tumorzellfibronektins auf die Immunzellen
The influence of fibronectin from osteoblasts and tumor cells on immune cells
Universität Hohenheim
Fibronektin
Osteoblaste
Tumorzelle
Immunzelle
Makrophage
Life sciences
Osteoblasten
Tumorzellen
Immunzellen
myeloide Vorläuferzellen
Makrophagen
fibroncetin
osteoblasts
tumor cells
immune cells
myeloid progenitor cells
macrophages
Die Rolle der osteoblastischen Nische bei der Hämatopoese ist Gegenstand aktueller Forschung. Diese Arbeit befasste sich mit der Funktion des Fibronektins, das von den Osteoblasten stammt, bei der Hämatopoese. Es zeigte sich durch die Abwesenheit des Osteoblastenfibronektins eine Erhöhung der hämatopoetischen Stammzellen und granulozytären monozytären Progenitoren (GMP). Durch Abwesenheit die Osteoblastenfibronektins fehlt vor allem die Fibronektinisoform EDA. Diese Arbeit konnte erstmals einen direkten Zusammenhang zwischen der Differenzierung der hämatopoetischen Stammzellen, sowie GMPs und EDA zeigen. Dies war assoziiert mit einer veränderten Expression von zwei Integrinen, α4β7 und α5β1. Die beeinträchtigte Differenzierung der GMPs führte zu einer Verminderung der monozytären und granulozytären Vorläuferzellen, welche vermehrt inflammatorische, tumorwachstumshemmende Zytokine produzieren. Es zeigte sich auch eine Verminderung der myeloiden Suppressorzellen (MDSCs), die normalerweise das Wachstum von Tumoren durch T-Zell vermittelte Immunsuppression und die Produktion von tumorfördernden Zytokinen begünstigen. Die Verminderung der MDSCs wäre somit bei der Bekämpfung von Tumoren von Vorteil. In der Tat zeigte sich ein verlangsamtes Tumorwachstum bei zwei Tumormodellen (murinen Melanomen und humanen Brustkrebsknochenmetastasen), was auf eine verminderte Anzahl der MDSCs und einer verstärkten Produktion von wachstumshemmenden Zytokinen der Monozyten zurückzuführen war. Dieser Effekt war T-Zell unabhängig. Durch Transferexperimente mit in vitro differenzierten myeloiden Vorläuferzellen in An- bzw. Abwesenheit von EDA und der Induktion von Melanomen konnte ein kausaler Zusammenhang zwischen vermindertem Tumorwachstum und Osteoblastenfibronektin bestätigt werden. Diese führten nach Anwesenheit von EDA während ihrer Differenzierung wieder zu einem vermehrten Tumorwachstum. Erstmals konnte somit ein Einfluss des Osteoblastenfibronektins auf die Immunzelldifferenzierung und deren späteren Funktion gezeigt werden.
Im zweiten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Verlust des endogenen FN bzw. des EDA von humanen Brustkrebszellen zu einem verminderten Wachstum und vermehrten Vorkommen von Makrophagen im Tumor führt. Das Zytokinprofil dieser Makrophagen zeigte, dass in Abwesenheit von EDA vermehrt tumorhemmende M1-Makrophagen im Tumor zu finden sind. Dass für das verminderte Tumorwachstum tatsächlich die Makrophagen verantwortlich sind, konnte die Depletion der Makrophagen in den Mäusen zeigen, da die Tumore danach wieder ein verstärktes Tumorwachstum aufwiesen. Es konnte somit erstmals ein Einfluss der veränderten Matrixproduktion auf Makrophagen in Tumoren gezeigt werden.
The function of the osteoblastic niche for the hematopoesis is an aim of recent research. This work shows, that fibronectin originating from osteoblasts leads to an increase of hematopoetic stem cells and granulocyte monocyte progenitors (GMP). The most abundant fibronectin isoform in OB is EDA. This thesis gives first evidence that there is a relationship between the differentiation of HSPC, GMPs and EDA. These results were associated with a changed expression in two intergrins, α4ß7 and α5ß1. The impaired differentiation of GMPs also leads to a decrease of myeloid and granulocyte progenitor cells. Additionally, myeloid progenitors displayed an increased production of cytokines inhibiting tumor growth. There also was a decrease of myeloid derived suppressor cells (MDSC), which are normally contributers of tumor growth through a t-cell suppression dependent mechanism and the production of tumor proliferating cytokines. The decrease of these cells should be benefical for the inhibition of tumor growth and indeed there was a decrease of tumor growth in two tumor models (murine melanoma and human breast cancer bone metastases). These results are due to the decreased number of MDSCs and the increased production of tumor proliferating cytokines. This effect was t-cell independent. A correlation between OB-FN and the inhibited tumor growth were verified by adoptive transfer experiments with in vitro differentiation of myeloid progenitor cells in presence and absence of EDA and the induction of melanoma. The presence of EDA during the differentiation was able to induce an increase of tumor growth again. This thesis presents for the first time the influence of osteoblast fibronectin in immune cell differentiation and indirectly on tumor growth.
The second part of this work suggests, that the deletion of fibronectin in tumor cells, especially of EDA, leads to an inhibted growth of human breast cancer cells in bone and in an increased number of macrophages in the tumor. The analysis of the cytokine production of tumor-associated macrophages showed a tumor inhibiting cytokine profil, which suggest, that the macrophages in the tumor are so called M1-macrophages. M1-macrophages are known to inhibit tumor growth. The depletion of macrophages with clodronate lipsomes in mice, leads indeed to an increase of tumor growth in absence of the tumor cell fibronectin. For the first time it was therefore show an influence of a changed extracellular matrix production on macrophages in tumors.
1424344907
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2015/1046/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2015/1046/pdf/Dissertation_Sabrina_Kraft.pdf
Kraft, Sabrina
Universität Hohenheim, Fakultätsübergreifend / Sonstige Einrichtung. Sonstige Einrichtungen
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Biologische Chemie und Ernährungswissenschaft
oai:opus.uni-hohenheim.de:1052
2015-03-03T10:00:51Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-10524
Der Einfluss des Stammzellmarkers ALDH und des EGFR-PI3 Kinase-Akt Signalwegs auf die Strahlenresistenz humaner Tumorzelllinien
Role of cancer stem cell marker ALDH and EGFR-PI3 Kinase-Akt signaling in radioresistance of human tumor cell lines
Universität Hohenheim
Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor
Strahlenresistenz
Life sciences
Tumorstammzellen
Aldehyd-Dehydrogenase
EGFR-PI3K Signalweg
PI3 Kinase
cancer stem cells
epidermal growth factor receptor
radioresistance
aldehyde dehydrogenase
PI3 kinase
Krebserkrankungen sind weltweit die zweithäufigste Todesursache in Industrie-nationen. Neben der chirurgischen Entfernung und chemotherapeutischen Behandlung des Tumors ist Bestrahlung die wichtigste Therapieform, die heutzutage ca. 60% der Patienten erhalten. Diese sprechen allerdings unterschiedlich auf die Strahlentherapie an. Auf der einen Seite gibt es gut heilbare Patienten mit relativ strahlensensiblen Tumoren. Andererseits jedoch kann Patienten mit sehr strahlen-resistenten Tumoren mittels Bestrahlung meist nicht geholfen werden. Der strahlenresistente Phänotyp bestimmter Zellen eines Tumors ist schuld an der Erfolglosigkeit der Therapie bzw. das Nicht-Ansprechen darauf. Man nimmt an, dass das Ergebnis der Therapie hauptsächlich davon abhängt, wie hoch das Potential der Strahlung ist, Wachstum, Proliferation und Überleben ganz bestimmter Krebszellen zu kontrollieren. Diese Zellen werden Tumorstammzellen (TSZ) oder Tumor-initiierende Zellen genannt. Basierend auf experimentellen Studien geht man davon aus, dass der Anteil von TSZ am Tumorvolumen in unterschiedlichen Tumorentitäten variiert, und im Allgemeinen relativ gering ist. Laut der Tumorstammzell-Hypothese hängt die individuelle Strahlenantwort von Tumoren von TSZ ab, da diese anscheinend langsam replizierenden Zellen die Fähigkeit besitzen, Tumore (also auch Rezidive) zu initiieren, sowie - wie normale Stammzellen - die Fähigkeit, sich selbst zu erneueren und die heterogenen Abstam-mungslinien eines Tumors zu generieren.
In der Strahlentherapie spielt neben der Existenz von TSZ auch die strahlenindu-zierte Aktivierung des Epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) und seinen downstream Signalkaskaden, wie z.B. dem Phosphoinositid-3 Kinase (PI3K)/Akt Signalweg, dem mitogen-activated protein kinase (MAPK) Signalweg und dem JAK/STAT Signalweg eine wichtige Rolle. Hierbei ist der PI3K/Akt Signalweg zentral für das Überleben von Tumorzellen nach Bestrahlung. Die Aktivierung von Akt führt zur Aktivierung der katalytischen Untereinheit der DNA-abhängigen Proteinkinase (DNA-PKcs). Dieses Enzym ist maßgeblich an der Reparatur von strahleninduzierten DNA-Doppelstrangbrüchen durch das Nicht-homologe end joining (NHEJ) beteiligt.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von TSZ für die Strahlenresistenz radioselektierter Klone von nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomzellen (NSCLC) und Brustkrebszellen zu untersuchen. Des Weiteren sollte die Beteiligung des EGFR-abhängigen PI3K/Akt/DNA-PKcs Signalings an möglicherweise TSZ-vermittelter Strahlenresistenz beleuchtet werden. Folgende Ergebnisse wurden erzielt:
1) Es konnten strahlenresistente Tumorzellpopulationen der Linien A549 (NSCLC) und SK-BR-3 (Brustkrebs) mittels eines Radioselektionsprozesses in vitro isoliert werden.
2) Radioselektierte Zellen zeigten eine verlängerte Verdopplungszeit sowie eine verringerte Koloniebildungseffizienz, was wahrscheinlich der Biologie von TSZ entspricht.
3) Von den untersuchten potentiellen TSZ-Markern CD133, Oct-4, Sox2 und Aldehyd-Dehydrogenase (ALDH) war einzig die Expression des embryo-nalen Stammzellmarkers Oct-4 in den radioselektierten Brustkrebszellen SK-BR-3 erhöht. Für A549 Zellen konnte jedoch gezeigt werden, dass eine erhöhte Aktivität der ALDH, nicht aber eine veränderte Proteinexpression, in Zusammenhang mit Strahlenresistenz steht.
4) Weiterhin konnte in Bezug auf diese Strahlenresistenz ein Zusammenhang zwischen ALDH-Aktivität und PI3K-Signalweg hergestellt werden.
5) Mittels siRNA konnte eine gegensätzliche Wirkung von ALDH1 und ALDH2 auf das Überleben von Tumorzellen nach Bestrahlung gezeigt werden. Während die ALDH1-Expression einen Vorteil für die untersuchten Zellen darstellte, bedeutete die ALDH2-Expression hier einen Nachteil.
6) Die Strahlenresistenz der radioselektierten A549 Zellen wurde teilweise durch eine EGFR/PI3K/DNA-PKcs-abhängige DNA-Doppelstrangbruch-reparatur vermittelt.
Aufgrund der in dieser Studie erzielten Ergebnisse lässt sich schlussfolgern, dass das gezielte Targeting des PI3K/Akt Signalwegs und der ALDH1 wichtige Vorgehensweisen in der Überwindung TSZ-vermittelter Resistenz von Tumoren während der Strahlentherapie darstellen könnten.
Cancer is the second leading cause of death in industriated nations. Besides surgury and chemotherapy, radiotherapy (RT) is an important approch by which about 60% of patients are treated. The response of these patients to RT is very heterogenous. On the one hand, there are patients with tumors which are radiosensitive and can be cured, but on the other hand patients bear tumors which are quite resistant to radiotherapy. A Radioresistant phenotype of tumor cells causes treatment failure consequently leading to a limited response to radiotherapy. It is proposed, that radiotherapy outcome mainly depends on the potential of radiation on controlling growth, proliferation and survival of a specific population of tumor cells called cancer stem cells (CSCs) or tumor-initiating cells. Based on experimental studies so far reported it is assumed that the population of CSC varies in tumors from different entities and is relatively low compared to the tumor bulk cells in general. According to the CSC hypothesis, it might be concluded that the differential response of tumors to radiotherapy depends on CSC populations, since these supposedly slow replicating cells are able to initiate a tumor, to self renew indefinitely and to generate the differentiated progeny of a tumor.
Besides the role of cancer stem cells in radiotherapy response, ionizing radiation (IR) activates the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream signaling pathways such as phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/Akt, mitogen-activated protein kinase (MAPK) and Janus kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription (JAK/STAT) pathways. Among these pathwas, PI3K/Akt is one of the most important pathways involved in post-irradiation survival: Activation of Akt results in activation of DNA-dependent protein kinase, catalytic subunit (DNA-PKcs). DNA-PKcs is a core enzyme involved in repair of IR-induced DNA-double strand breaks (DNA-DSB) through non-homologous end joining (NHEJ).
The aim of the present study was to investigate the role of CSCs in resistance of radioselected subclones of non-small cell lung cancer (NSCLC) and breast cancer cells to irradiation. Additionally, the role of EGFR dependent PI3K/Akt/DNA-PKcs signaling in the context of CSC-mediated radiotherapy resistance was investigated. The following major results were obtained:
1) Radioresistant tumor cells from NSCLC-A549 cells as well as SK-BR-3 breast cancer cells could be isolated in vitro by a radioselection process.
2) In line with the proposed CSC biological behaviors radioselected cells presented extended population doubling time and decreased plating efficiency.
3) Among identified potential CSC markers such as CD133, Oct-4, Sox2 or aldehyde dehydrogenase (ALDH) expression, solely expression of the embryonic stem cell marker Oct-4 was increased in the radio-selected SK-BR-3 cells. However, increased ALDH activity but not enhanced ALDH protein expression was associated with radioresis-tance of A549 cells.
4) Respectively, ALDH activity was found to be involved in radio-resistance partially through PI3K pathway.
5) Using an siRNA approach, a differential effect of ALDH1 vs ALDH2 in terms of post-irradiation survival of tumor cells was demonstrated. In this context and in contrast to the role of ALDH2 a prosurvival effect of ALDH1 could be observed.
6) Radioresistance of IR-selected tumor cells was partially mediated through EGFR/PI3K/DNA-PKcs-dependent accelerated repair of DNA-DSBs.
Thus, based on the described major findings in this study it is proposed that targeting of PI3K/Akt pathway and ALDH1 might be effective approaches towards overcoming CSC-mediated radiotherapy resistance.
1425373251
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2015/1052/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2015/1052/pdf/Dissertation_Julia_Mihatsch_2014.pdf
Mihatsch, Julia
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Zoologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:1184
2016-04-11T11:14:01Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-11844
Safety assessment of coagulase-negative staphylococci used in food production
Universität Hohenheim
Hämolysin
Enterotoxin
Biogene Amine
Bindeproteine
Microarray
Life sciences
Antibiotikaresistenz
Koagulase-negative Staphylokokken
Starterkultur
Lebensmitte l, Sicherheitsbewertung
QPS
Coagulase-negative staphylococc i
Starter culture
Food, Safety assessment
QPS
Coagulase-negative staphylococci (CNS) are used in starter cultures for the production of fermented meat products due to their involvement in the development of desired red color, characteristic flavor as well as ensuring stability. But also other CNS species like S. condimenti, S. piscifermentans, S. equorum and S. succinus have a potential for future use in starter cultures. The safety of fermented food products is principally proven by long-term experience as traditional methods are considered safe based on their long history of safe use. However, for the last mentioned species long-term experience concerning sanitary harmlessness exists only with limitations.
To get an insight in safety relevant properties of food associated CNS in Chapter III-V strains of the species S. carnosus, S. condimenti and S. piscifermentans (S. carnosus-group) as well as S. equorum, S. succinus and S. xylosus (S. xylosus-group) were phenotypically and partly genotypically investigated. Based on these insights in Chapter VI a DNA microarray was developed for rapid and simultaneous detection of various safety relevant properties in CNS with future use in the food production. To increase the application potential of this microarray, additionally technological relevant properties were considered in the array design. Subsequently, the designed microarray was used for the genotypic investigation of phenotypically characterized CNS concerning the presence of safety relevant properties.
In Chapter III, antibiotic resistances of 330 CNS belonging to S. carnosus- and S. xylosus-group isolated from food and starter cultures were examined. Resistances to 21 antibiotics were phenotypically determined and resistance genes blaZ, lnuA and tetK were detected in strains showing phenotypic resistances to ß-lactam antibiotics, lincomycin and tetracycline. Antibiotic resistance profiles in strains of the species S. equorum, S. succinus and S. piscifermentans are described and due to the high number of investigated strains an insight regarding the occurrence of antibiotic resistances in food associated CNS is given.
In Chapter IV toxin production of food associated CNS belonging to S. carnosus- and S. xylosus-group was investigated. First, 330 strains isolated from food, starter cultures and clinical isolates have been analyzed to hemolytic activity on human and sheep blood agar plates. Secondly, the ability of 35 selected strains to produce staphylococcal enterotoxins, toxic shock syndrome toxin 1 and exfoliative toxin A has been examined by immunoblot analysis. The chapter demonstrates that CNS strains present in high numbers in fermented food cannot necessarily be regarded as safe. Thus, strains used in the production of fermented food should be analyzed with respect of their toxigenic potential to avoid negative effects on human health.
Chapter V is dealing with the formation of binding proteins to extracellular matrix proteins (ECM) and the production of biogenic amines (BA) by 32 CNS of S. carnosus- and S. xylosus-group. Binding capacity of CNS to the ECM fibronectin and fibrinogen was investigated by detection of fluorescent labeled cells which were added to microtiter plates coated with ECM. The formation of six important BA was examined by HPLC using growing and resting cells. By the results of this chapter the ability of food associated CNS to develop undesired properties like the formation of binding proteins to ECM and BA was demonstrated. Thus, further research is needed concerning potential risks and the importance on human health if strains with these properties are used in the production of fermented food.
In Chapter VI, the design of a polynucleotide based DNA microarray as screening tool to detect genes of potential health concern and technological relevance in food associated CNS is described. The array considered 220 genes encoding for antibiotic resistances, hemolysins, toxins, amino acid decarboxylases (involved in the formation of BA), binding proteins to ECM, lipases, proteases, stress response factors, and nitrate dissimilation. Hybridization experiments were performed using genomic DNA isolated of 32 in Chapter III-V phenotypically characterized CNS allowing the detection of e.g. antibiotic resistance genes blaZ, lnuA, and tetK. Genes coding for decarboxylases as well as fibronectin and fibrinogen binding proteins were rarely correlated with the phenotype. Toxin genes could not be detected, whereas technological relevant genes like genes coding for proteases, lipases, catalase, superoxide dismutase or genes involved in dissimilatory nitrate reduction resulted in hybridization signals.
The present thesis provides data concerning safety relevant properties in food associated CNS which are important for accurate safety assessment. Comparison of the results of Chapter III-V with them of Chapter VI showed that antibiotic resistances, formation of toxins and binding proteins to ECM are more present in strains of S. xylosus- than in S. carnosus-group. In context with safety assessment of food associated CNS, the designed microarray can be used as screening tool for the detection of safety relevant combined with technologically important properties (nitrate dissimilation, control of oxidative damage by catalase, flavor formation by proteases and lipases). Summarizing, the array is able to make a contribution in enhancing the selection criteria of CNS used as starter organisms in respect to food safety as well as technologically relevant properties.
Koagulase negative Staphylokokken (KNS) werden in Starterkulturen für die Herstellung von fermentierten Fleischprodukten zur Umrötung, charakteristischen Aromabildung sowie zur Gewähr¬leistung der Produktstabilität eingesetzt. Traditionell enthalten Starterkulturen KNS der Spezies S. carnosus und S. xylosus, aber auch andere KNS Spezies wie S. condimenti, S. piscifermentans, S. equorum und S. succinus haben ein Potential für den zukünftigen Einsatz in Starter¬kulturen. Die Sicherheit von fermentierten Lebensmitteln basiert zumeist auf Langzeiterfahrung infolge der sicheren Historie von traditionellen Methoden. Zuletzt genannte Spezies haben jedoch nur eine eingeschränkte Langzeiterfahrung hinsichtlich der gesundheit¬lichen Unbedenklichkeit.
Zur Bestimmung sicherheitsrelevanter Eigenschaften von lebensmittelassoziierten KNS wur¬den im Kapitel III-V Stämme der Spezies S. carnosus, S. condimenti und S. piscifermentans (S. carnosus-Gruppe) sowie S. equorum, S. succinus und S. xylosus (S. xylosus-Gruppe) phäno¬typisch und teils genotypisch untersucht. Weiterführend wurde im Kapitel VI ein DNA-Chip zum schnellen und simultanen Nachweis sicherheitsrelevanter Eigenschaften in KNS mit zu¬künftigem Einsatz in der Lebensmittelherstellung entwickelt. Um das Anwendungspotential des DNA-Chips zu erhöhen wurden bei der Konzeption des Chips technologisch relevante Eigenschaften mitberücksichtigt. Anschließend wurden phänotypisch charakterisierte KNS mit dem entwickelten Chip genotypisch auf sicherheitsrelevante Eigenschaften untersucht.
In Kapitel III wurden 330 KNS der S. carnosus- und S. xylosus-Gruppe isoliert aus Lebensmitteln und Starterkulturen phänotypisch hinsichtlich der Resistenzen gegenüber 21 Antibiotika charakterisiert sowie die Resistenzgene blaZ, lnuA und tetK in Stämmen mit phänotypischer ß-Lactam-, Lincomycin- und Tetracyclin-Resistenz bestimmt. Die Studie beschreibt Antibiotikaresistenzprofile von Stämmen der Spezies S. equorum, S. succinus und S. piscifermentans und gibt durch die hohe Anzahl an untersuchten Stämmen einen Einblick in das Vorkommen von Antibiotika¬resistenzen in lebensmittelassoziierten KNS.
In Kapitel IV wird die Bildung von Toxinen in lebensmittelassoziierten KNS der S. carnosus- und S. xylosus-Gruppe untersucht. Die hämolytische Aktivität auf Human- und Schafblutagar wurde von 330 Stämmen aus Lebensmitteln, Starterkulturen und klinischen Isolaten bestimmt sowie die Bildung von Staphylokokken-Enterotoxinen, Toxischen Schocksyndrom Toxin 1 und Exfoliativen Toxin A von 35 Stämmen mittels Immunoblot-Verfahrens. Das Kapitel zeigt, dass KNS die vielfach in fermentierten Lebensmitteln vorkommen, nicht generell als sicher betrach¬tet werden können. Um negative Effekte auf die humane Gesundheit zu vermeiden sollte das toxigene Potential von in der Lebensmittelherstellung eingesetzten Stämmen bestimmt werden.
Kapitel V befasst sich mit der Bildung von Bindeproteinen an Extrazelluläre Matrixproteine (EZM) und von biogenen Aminen (BA) in 32 KNS Stämmen der S. carnosus- und S. xylosus-Gruppe. Die Bindekapazitäten an die EZM Fibronektin und Fibrinogen wurden mittels Mikrotiterplatten-Assays durch Fluoreszenzdetektion markierter Bakterienzellen an mit EZM beschichtete Mikrotiterplatten bestimmt. Die Bildung sechs wichtiger BA wurde mit HPLC sowie wachsenden und ruhenden Zellen untersucht. Dieses Kapitel demonstriert, das lebens¬mittelassoziierte KNS in der Lage sind unerwünschte Eigenschaften wie Bindeproteine an EZM und BA zu bilden. Daher ist weiterer Forschungsbedarf bezüglich potentieller Risiken und der Bedeutung in der menschlichen Gesundheit erforderlich, wenn Stämme mit diesen Eigen¬schaften zur Herstellung fermentierter Lebensmittel eingesetzt werden.
Kapitel VI beschreibt die Konzeption eines Polynukleotid-basierenden DNA-Chips als Hilfs¬mittel zum Screenen von Genen mit möglicher gesundheitlicher und technologischer Rele¬vanz in lebensmittelassoziierten KNS. Auf dem DNA-Chip sind 220 Gene für Antibiotika¬resistenzen, Hämolysine, Toxine, Aminosäuredecarboxylasen (BA Bildung), EZM Binde¬proteine, Lipasen, Proteasen, Nitratatmung, Salz- und oxidative Stresstoleranz abgelegt. Die Hybridisierungen wurden mit genomischer DNA von 32, in Kapitel III-V phänotypisch unter¬suchten KNS, durchgeführt und können z.B. die Antibiotikaresistenzgene blaZ, lnuA, und tetK nachweisen. Gene, die für Decarboxylasen sowie Fibronektin- und Fibrinogen-Bindeproteine kodieren zeigten selten Übereinstimmung mit dem Phänotyp. Toxingene wurden nicht nach¬gewiesen. Technologisch relevante Gene (Proteasen, Lipasen, Katalase, Superoxiddismutase und Gene der dissimilatorischen Nitratreduktion) resultierten in Hybridisierungssignalen.
Die Ergebnisse tragen zum Wissen über sicherheitsrelevante Eigenschaften lebensmittel¬assoziierter KNS bei, welches für eine präzise Sicherheitsbewertung erforderlich ist. Ein Vergleich der Ergebnisse aus Kapitel III-V und Kapitel VI zeigt, dass in der S. xylosus-Gruppe Antibiotika¬resistenzen sowie die Bildung von Toxinen und Bindeproteinen an EZM häufiger vorkommen als in der S. carnosus-Gruppe. Bei der Sicherheitsbewertung lebensmittel¬assoziierter KNS kann der konzipierte DNA-Chip als Hilfsmittel für ein kombi¬niertes Screening sicherheits- und technologisch relevanter Eigenschaften (Nitratreduktion, Kontrolle oxidativer Abbau durch Katalase, Geschmack- und Aromaverbesserung durch Proteasen und Lipasen) herangezogen werden. Zusammenfassend trägt der DNA-Chip dazu bei die Auswahlkriterien von KNS, die als Starterorganismen verwendet werden, hinsichtlich der Lebensmittelsicherheit und technologisch relevanter Eigenschaften zu verbessern.
1460365899
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1184/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1184/pdf/Dissertation_Marion_Seitter_2015_OPUS.pdf
Seitter, Marion
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:1191
2016-04-11T11:24:29Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-11913
Functional and structural studies of a C-terminally extended YidC
Universität Hohenheim
Escherichia coli
Proteintransport
Signalerkennungspartikel
Rhodopirellula baltica
Ribosom
Life sciences
YidC Insertase
MscL Protein
Membraninsertion
Cryo-EM
Microscale Thermophorese
membrane insertion
ribosome
SRP targeting
YidC insertase
Cryo-EM reconstruction
Members of the YidC/Oxa1/Alb3 protein family catalyze the insertion of integral membrane proteins into the lipid bilayer of the bacterial plasma membrane (YidC), the inner mitochondrial membrane (Oxa1), and the chloroplast thylakoid membrane (Alb3) (Saller et al., 2012; Dalbey et al., 2014). The insertase homologs are comprised of a conserved core region of 5 transmembrane domains, but are provided with additionally flanking N- and C-terminal regions of variable lengths and functions. The Gram-negative YidC is characterized by an additional N-terminal domain, while Gram-positive bacteria, mitochondria and plastids developed C-terminally extended insertase-domains. These domains are involved e.g. in direct interaction with ribosomes and facilitate a functional overlap with the co-translational SRP-targeting pathway. An extended C-terminal highly positively charged tail region was also found in the YidC homologs of the Gram-negative marine bacteria Rhodopirellula baltica and Oceanicaulis alexandrii, but not in Escherichia coli.
The primary subject of this work was to characterize and analyze in detail the C-terminally extended YidC chimera, composed of the E. coli YidC and the C-terminally extended domains of the marine YidC homologs. Biochemical binding assays with the purified YidC proteins and isolated, vacant E. coli 70S ribosomes showed that the C-tails mediate specific binding to ribosomes independently of the translational state of the ribosome. Furthermore, a ribosome-bound insertase complex was visualized by cryo-electron microscopy. The enhanced affinity of the C-terminally extended YidC was used to isolate stable complexes with stalled ribosomes, carrying a nascent polypeptide chain of a YidC substrate protein (MscL). The cryo-EM structure of a YidC-ribosome nascent chain complex (RNC) was solved to a 8,6 Å resolution and allowed the visualization of the nascent chain from the peptidyl transferase center through the ribosomal exit tunnel into the YidC density. The structure revealed the helix H59 of the 23S rRNA and the two ribosomal proteins L24 and L29 as the major contacts sites of YidC at the ribosomal tunnel exit. Pull down assays confirmed a significantly interaction of the C-terminal ribosome binding domain and the ribosomal protein L29, while L24 seems to be a universal contact site for the YidC-insertase core domain. Strikingly, the cryo-EM structure clearly showed a single monomer of YidC bound to the translating ribosome. This suggests that monomeric YidC might be the minimal functional unit for YidC-dependent, co-translational insertion of inner membrane proteins.
In addition to the in vitro tests, a possible role of the C-terminal YidC extensions in co-translational protein targeting was tested in vivo in E. coli. For that purpose the targeting and localization of the SRP-dependent YidC-substrate protein MscL (Facey et al., 2007) was investigated as a GFP fusion protein via fluorescence microscopy. In addition, the proper membrane insertion of MscL was analyzed in radioactive pulse chase experiments via AMS gel shift assays, either in the absence of a functional SRP or SRP receptor (FtsY). Both in vivo assays clearly showed that the C-terminal ribosome binding domain of the R. baltica YidC homolog can partially substitute for the SRP receptor function in E. coli, while the cytosolic signal recognition particle is still required for correct insertion of the MscL protein. Therefore, a new co-translational targeting and insertion model of YidC-only substrates was proposed. This works also highlights evolutionary aspects of the accessory YidC domains and indicates that the C-terminal extended tail of YidC in the planctomycete group may be an ancestral remnant of a primordial translocation system operating without a typical SRP receptor.
The second part focuses on the interaction of the signal recognition particle with SRP signal sequences. Isolated mutant signal sequence peptides were used to determine the specificity of SRP recognition in proteins. The interaction studies were established in an in vitro system and binding affinities of purified SRP to the isolated signal sequence peptides were determined via microscale thermophoresis (MST). A short sequence of 27 amino acid residues at the very N-terminal tail of the large cytoplasmic domain of KdpD was identified as a SRP signal sequence. Furthermore, a direct influence of the amino acid composition in the signal peptide on its SRP binding affinity in vitro was demonstrated. This confirms a low influence of an altered charge in the N-terminal region while mutations in the hydrophobic core region causes significantly reduced binding affinities to SRP. Taken together, this study contributes to the understanding of the molecular mechanisms of co-translational membrane protein biogenesis in bacteria.
Proteine aus der YidC/Oxa1/Alb3-Famile vermitteln die direkte Insertion von integralen Membranproteinen in den Lipid-Bilayer der bakteriellen Plasmamembran (YidC), in die innere Mitochondrien-Matrix (Oxa1) und in die Thylakoidmembran von Chloroplasten (Alb3) (Saller et al., 2012; Dalbey et al., 2014). Die Homologe dieser Insertase-Familie besitzen eine konservierte Kernregion aus 5 Transmembrandomänen und zusätzliche N- und C-terminale Regionen, die sich in ihrer Länge und Funktion stark voneinander unterscheiden. Charakteristisch für das YidC aus Gram-negativen Bakterien ist eine zusätzliche N-terminale Transmembrandomäne, während Mitochondrien und Plastide C-terminal verlängerte, hydrophile Domänen an ihren Insertasen besitzen. Diese C-terminalen Domänen sind zum Beispiel an der direkten Bindung von Ribosomen beteiligt und verleihen der Insertase co-translationale Funktionen die sich mit dem SRP-Targetingmechanismus überschneiden. Im Gegensatz zur YidC-Insertase aus E. coli, besitzen die Gram-negativen, marinen Bakterien Rhodopirellula baltica und Oceanicaulis alexandrii YidC Homologe mit C-terminal erweiterten, positiv geladenen, hydrophilen Domänen.
Ziel dieser Arbeit war die detaillierte Charakterisierung und Analyse von C-terminal erweiterten YidC-Chimären. Die YidC-Chimären bestehen aus Fusionen des E. coli YidC Proteins und den C-terminalen Domänen der marinen YidC Homologe. Biochemische Bindungsstudien mit den gereinigten YidC-Proteinen und isolierten E. coli 70S Ribosomen zeigten, dass die C-terminalen Domänen eine spezifische Bindung an die Ribosomen vermitteln. Ähnlich zu der essentiellen Funktion der C-terminalen Domäne von Oxa1 war die Ribosomenbindung der YidC-Chimären unabhängig von einer translatierten Polypeptidkette am Ribosom. Des Weiteren, wurde ein Komplex aus naszierendem Ribosom (RNC) und gebundener YidC-Chimäre mittels Kryo-Elektronenmikroskopie auf 8,6 Å gelöst. In der Struktur konnte man den Weg der wachsenden Polypeptidkette vom Peptidyltransferase-Zentrum, durch den Ausgangstunnel des Ribosoms bis hinein in das YidC Protein verfolgen. Mit Hilfe der Kryo-EM Struktur wurde die Helix H59 der 23S rRNA und die beiden ribosomalen Proteine L24 und L29 als Hauptkontakte des YidCs am Ribosom identifiziert. Durch Pull-Down Versuche konnte eine signifikante Interaktion der C-terminalen Domäne mit L29 gezeigt werden, wohingegen L24 vermutlich eine Interaktion mit der YidC-Kerndomäne eingeht. Außerdem lieferte die Struktur des YidC:RNC Komplexes den Beweis, dass ein einzelnes YidC-Molekül an translatierende Ribosomen bindet und somit vermutlich die minimalste, funktionelle Einheit für die YidC-abhängige, co-translationale Insertion von Membranproteinen darstellt.
Um die in vivo-Funktion der C-terminalen YidC Domänen während des co-translationalen Targetings in E. coli zu untersuchen, wurde das Membrantargeting des SRP-abhängigen YidC-Substratproteins MscL (Facey et al., 2007) als GFP-Fusionsprotein mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Parallel dazu wurde die korrekte Membraninsertion von MscL über eine AMS-Modifizierung in radioaktiven pulse-chase Experimenten analysiert. Beide in vivo Untersuchungen zeigten, dass die C-terminale Ribosomenbindedomäne des R. baltica YidC Homologs zu einem gewissen Teil die Funktion des SRP-Rezeptors in E. coli übernehmen kann. Dabei wird jedoch SRP weiterhin für die korrekte Insertion von MscL benötigt. In dieser Arbeit werden ebenfalls evolutionäre Aspekte der akzessorischen YidC-Domänen behandelt, die darauf schließen lassen, dass die C-terminale YidC-Domäne in der Gruppe der Planktomyceten eine Art Überbleibsel eines Vorfahren mit primitivem Translokationssystem ohne klassischem SRP-Rezeptor ist.
Der zweite Teil dieser Arbeit behandelt die Interaktion des Signal-Erkennungs-Partikel (SRP) mit SRP-Signalsequenzen. Um die Spezifität der SRP-Erkennung von Proteinen zu bestimmen wurden isolierte Peptide mit verschiedenen Signalsequenzmutationen verwendet. Die Bindungsaffinitäten der in vitro Interaktionsstudien von SRP und den Signalsequenz-peptiden wurden mittels Microscale Thermophorese (MST) bestimmt. Eine Sequenz von 27 Aminosäureresten am Anfang der großen N-terminalen, cytoplasmatischen Domäne des KdpD Proteins wurde als SRP-Signalsequenz identifiziert. Darüber hinaus konnte ein direkter Einfluss der Aminosäurekomposition im Signalpeptid auf die Bindungsaffinität zu SRP in vitro gezeigt werden. Während die Ladungsänderung in der N-terminalen Region des Signalpeptids nur einen geringen Einfluss auf die Interaktion mit SRP hatte, zeigten Mutationen in der hydrophoben Kernregion des Peptids eine deutlich verringerte Bindeaffinität zu SRP. Beide Teilaspekte dieser Arbeit tragen zum Verständnis des molekularen Mechanismus der co-translationalen Biogenese von integralen Membran-proteinen in Bakterien bei.
1460366669
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1191/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1191/pdf/Dissertation_Ines_Seitl.pdf
Seitl, Ines
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Mikrobiologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:1194
2016-06-07T07:45:38Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-11947
Functional validation of genetic changes discovered in high-throughput mutational and copy number screens with respect to carcinogenesis and treatment sensitivity for Head and Neck Cancer
Universität Hohenheim
Humanes Papillomavirus
Life sciences
Kopf- und Halstumoren
Untergruppen
Sequenzierung
FGFR3
Head and Neck Cancer
Subtypes
Sequencin g
HPV
FGFR3
Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a heterogeneous disease regarding both anatomic location and molecular characteristics. It is comprised of two distinct disease entities - human papillomavirus (HPV)-positive and HPV-negative HNSCC - that differ regarding primary site of disease as well as aetiology/pathogenesis. Persistent infection with high-risk HPV is causally related to oropharyngeal HNSCC, whereas tobacco and alcohol consumption are linked to the development of HPV-negative head and neck cancers. HPV(+) and HPV(-) HNSCC differ regarding their clinical behavior as well as prognosis with HPV(+) tumors being associated with a more favorable prognosis than HPV(-) tumors. However, besides Cetuximab, a monoclonal antibody against the epidermal growth factor receptor (EGFR), which is used with modest success as no predictive biomarkers have been identified, no targeted treatments are available that consider the biologic heterogeneity and no classification is used in clinical practice that reflects the underlying biology of the disease. As a consequence, all patients are treated uniformly with a combination of surgery, radiation, and chemotherapy depending on stage and location of the tumor. In this study, a homogeneous and clinically annotated cohort of 134 treatment-naive HNSCC specimens, including 59 HPV(+) samples (44%), were processed, subjected to Agilent 4X44Kv2 gene expression arrays and Nanostring copy number assays, and analyzed together with all available HNSCC cohorts (n=938). As a result, a clinically meaningful classification was identified for HNSCC - which was hampered in previous studies due to a limited inclusion of HPV(+) samples, unknown HPV status, small sample size, or missing clinical annotation. Three HNSCC supergroups were identified - basal (BA), classical (CL), inflamed/mesenchymal (IMS) - and further subdivided by HPV status into five HNSCC subtypes - BA, CL-HPV, CL-nonHPV, IMS-HPV, IMS-nonHPV - that differ regarding survival and show different expression profiles and copy number (CN) aberrations. Importantly, two HPV-associated subtypes with different molecular profile and prognosis were identified - CL-HPV and IMS-HPV. The IMS subtypes show a strong immune phenotype with expression of immune response genes and may benefit from immune therapies such as programmed cell death protein 1 (PD-1) inhibitors. The BA subtype shows markedly increased expression of EGFR and hypoxia related genes, which might render these tumors susceptible to EGFR-targeting and hypoxia-targeting therapies. Besides differences regarding their biological and clinical behavior, HPV(+) and HPV(-) HNSCC show a distinct mutational landscape. The incidence of HPV(+) tumors is rising, however, studies are missing that investigate a sufficient number of HPV(+) tumors to derive meaningful information and assign targetable genomic changes to either disease entity. 120 (51 HPV(+), 69 HPV(-)) out of the cohort of 134 samples were further used to build DNA sequencing libraries and processed to next generation sequencing (NGS) on the Illumina platform (Illumina HiSeq 2000/2500 sequencers) to detect novel or targetable genomic changes. The overall mutational burden is similar in both disease entities, however, the mutational landscape differs. In addition to known aberrations, novel targetable aberrations with predicted driver potential are identified in various genes, among which are EGFR, CCND1, and FGFR1 in HPV(-) tumors, and FGFR2/FGFR3, KRAS, BRCA1/2 in HPV(+) tumors, as well as PIK3CA and PI3K pathway genes in both and rare aberrations in DDR2 and EPHA2. The fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) S249C mutation is recurrently found in six HPV(+) tumors, which makes FGFR3 the second most mutated gene in HPV(+) tumors - after the well-known oncogene PIK3CA. Therefore, functional validation of FGFR3 S249C was performed in vitro in the two HNSCC cell lines SCC47 and 93VU147T. Two different FGFR3 isoforms were identified in all six FGFR3 mutated HNSCC tumor samples - FGFR3IIIb and the soluble FGFR3Delta8-10. Both isoforms were used to stably transfect the S249C mutation into SCC47 and 93VU147T and to study its effects on proliferation and migration as well as FGFR3 signaling. No effect on proliferation or migration rate is seen beyond an increase in proliferation rate in SCC47 cells transfected with wild type (WT) FGFR3IIIb. No constitutive activation of downstream pathways is seen in unstimulated SCC47 cells. Investigation of different downstream signaling pathways identifies the MAPK and the PI3K/Akt pathway as the two important signaling pathways downstream of FGFR3 in HNSCC cell lines. FGFR3 S249C cannot be confirmed as an oncogenic driver in SCC47 and 93VU147T. However, its possible role as an oncogenic co-driver besides other receptor tyrosine kinases and its function in drug resistance mechanisms - especially resistance to EGFR inhibitors - remain to be investigated.
Plattenepithelkarzinome im Kopf- und Halsbereich (HNSCC) umfassen eine Gruppe heterogener Tumoren, sowohl hinsichtlich ihrer anatomischen Lokalisation als auch ihrer molekularen Eigenschaften. Sie werden differenziert in human papillomavirus (HPV)-positive und HPV-negative Karzinome, die sich bezüglich Lokalisation und Risikofaktoren unterscheiden. Persistierende Infektionen verursacht durch high-risk HPV begünstigen die Entstehung von HNSCC im Oropharynx, Tabak- und Alkoholkonsum sind Risikofaktoren für HPV(-) HNSCC. Die Unterscheidung in HPV(+) und HPV(-) spiegelt sich klinisch sowohl im unterschiedlichen Therapieansprechen als auch in der günstigeren Prognose für HPV(+) HNSCC wider. Der monoklonale, gegen den epidermal growth factor receptor (EGFR) gerichtete Antikörper Cetuximab ist derzeit die einzige zugelassene zielgerichtete Therapie zur Behandlung von HNSCC. Cetuximab wird mit mäßigem Erfolg eingesetzt, da bislang keine prädiktiven Biomarker bekannt sind. Darüber hinaus gibt es weder zielgerichtete Therapien noch eine Klassifikation, die die molekulare Heterogenität der Erkrankung berücksichtigen. In der Folge werden alle Patienten abhängig von Staging sowie Lokalisation des Tumors meist mit einer Kombination aus Chemotherapie und Bestrahlung behandelt und einem chirurgischen Eingriff unterzogen. Eine homogene, klinisch dokumentierte Kohorte von 134 unbehandelten HNSCCs, davon 59 HPV(+) (44%), wurde mittels Agilent 4X44Kv2 gene expression arrays und Nanostring Copy Number Assays untersucht und zusammen mit bereits vorhandenen HNSCC Daten ausgewertet (n=938). Im Gegensatz zu publizierten kleineren Studien mit unzureichender klinischer Dokumentation sowie einem geringen Anteil von HPV(+) Tumoren, ergibt sich hierdurch eine klinisch relevante Klassifikation von HNSCC in drei Hauptgruppen - basal, classical, inflamed/mesenchymal (BA, CL, IMS) - welche anhand ihres HPV Status in fünf Untergruppen unterteilt werden können (BA, CL-HPV, CL-nonHPV, IMS-HPV, IMS-nonHPV). Diese unterscheiden sich hinsichtlich Prognose, Genexpression und Gen-Kopienzahl. Es wurden zwei verschiedene HPV(+) Untergruppen identifiziert (CL-HPV und IMS-HPV), welche deutliche Unterschiede bezüglich ihres molekularen Profils und ihrer Prognose aufweisen. Expression von immune-response-Genen in den IMS Untergruppen ist möglicherweise ein Biomarker für das Ansprechen auf Immuntherapien mit programmed cell death protein 1 (PD-1) Inhibitoren. Überexpression von EGFR und hypoxie-induzierten Genen ist charakteristisch für die BA Untergruppe und könnte ein Indikator für die Wirksamkeit von anti-EGFR und anti-Hypoxie Therapien sein. HPV(+) und HPV(-) Tumoren weisen Unterschiede bezüglich ihrer Biologie, ihres klinischen Erscheinungsbildes und der für sie charakteristischen Mutationen auf. Trotz steigender Inzidenz von HPV(+) Tumoren gibt es bislang keine Studien, die eine hinreichende Anzahl von HPV(+) Tumoren untersuchen, um aussagekräftige Informationen abzuleiten. DNA sequencing libraries von 120 Tumoren (51 HPV(+), 69 HPV(-)) aus der Kohorte von 134 wurden sequenziert (Illumina HiSeq 2000/2500 Sequenzierer), um behandelbare genomische Veränderungen zu identifizieren. Während die Anzahl der Mutationen in beiden HNC-Arten ähnlich ist, unterscheiden sich diese hinsichtlich der Art der genomischen Veränderungen. Es wurden sowohl bereits bekannte als auch neue, behandelbare potenzielle Driver identifiziert: EGFR, CCND1 und FGFR1 in HPV(-) HNSCC, FGFR2/FGFR3, KRAS und BRCA1/2 in HPV(+) HNSCC, PIK3CA und Gene des PI3K Signalweges in beiden Unterarten sowie selten vorkommende Aberrationen in DDR2 und EPHA2. Die fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) Mutation S249C wurde in sechs HPV(+) Tumoren identifiziert und ist somit nach PIK3CA die häufigste Mutation in HPV(+) HNSCC. Die funktionelle Validierung von FGFR3 S249C wurde in zwei HNSCC Zelllinien durchgeführt. Zwei verschiedene Isoformen von FGFR3, FGFR3IIIb und der nicht membrangebundene, lösliche FGFR3Delta8-10 wurden in allen sechs FGFR3 mutierten Tumorproben identifiziert. Zwei stabile Zelllinien, SCC47 und 93VU147T, wurden hergestellt und die Effekte von FGFR3IIIb S249C und FGFR3Delta8-10 S249C auf Proliferation und Migration sowie FGFR3 Signaling wurden untersucht. FGFR3 S249C beeinflusst nicht die Proliferations- und Migrationsrate der untersuchten Zelllinien, mit Ausnahme von FGFR3IIIb wild type (WT), welcher zu einem Anstieg der Proliferation in SCC47 führt. Eine konstitutive Aktivierung von Signalwegen downstream von FGFR3 wurde nicht verzeichnet. MAPK sowie PI3K/Akt wurden nach Stimulation von FGFR3 als relevante Signalwege in HNSCC identifiziert. Eine Bestätigung von FGFR3 S249C als Driver in HNSCC ist anhand der erlangten Daten nicht möglich. Die Rolle von FGFR3 S249C als Co-Driver zusammen mit weiteren Rezeptortyrosinkinasen sowie deren Funktion in Resistenzmechanismen, insbesondere der Resistenz gegen EGFR-Inhibitoren, sollte jedoch Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein.
1465278338
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1194/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1194/pdf/DocThesisMK_081715_FINAL_2sided.pdf
Keck, Michaela-Kristina
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Biologische Chemie und Ernährungswissenschaft
oai:opus.uni-hohenheim.de:1215
2016-06-09T09:20:32Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-12150
Untersuchung der lichtabhängigen Phosphorylierung des TRP-Kanals von Drosophila melanogaster
Investigation of the light-dependent phosphorylation of the TRP channel of Drosophila melanogaster
Universität Hohenheim
Drosophila
Kanal
Auge
Life sciences
TRP
Phosphoylierung
Drosphila
TRP
phosphorylation
eye
Die Phototransduktionskaskade im Auge von Drosophila melanogaster mündet in der Öffnung der beiden Ionenkanäle TRP und TRPL. Der hierdurch hervorgerufene intrazelluläre Anstieg der Natrium- und Calciumionenkonzentration führt zur Ausbildung des Photorezeptorpotentials. Der TRP-Kanal unterliegt dabei einer lichtabhängigen Phosphorylierung, wobei 15 seiner Phosphorylierungsstellen eine verstärkte Phosphorylierung im Licht zeigen und eine Phosphorylierungsstelle eine verstärkte Phosphorylierung im Dunkeln aufweist. Zu Beginn dieser Arbeit waren weder die Funktion der lichtabhängigen TRP-Phosphorylierung, noch die an ihr beteiligten Kinasen und Phosphatasen bekannt.
In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb nach Kinasen und Phosphatasen gesucht, die das Phosphorylierungsmuster des TRP-Kanals beeinflussen. Hierzu wurde ein Kandidaten-Screen mit 79 Kinase- und Phosphatasemutanten durchgeführt unter Verwendung von drei phosphospezifischen Antikörpern. In dem Screen wurden acht Kinasen und eine Phosphatase identifiziert, die die Phosphorylierung einer oder mehrerer der drei untersuchten Phosphorylierungsstellen beeinflussen. So zeigten die Mutanten der augenspezifischen Proteinkinase C (ePKC) und der Proteinkinase C 53E (PKC53E) eine verringerte Phosphorylierung an der Stelle T849 des TRP-Kanals, während die Mutanten der Kinase Rolled und der alpha-Untereinheit der AMP-abhängigen Kinase eine erhöhte Phosphorylierung an dieser Stelle zeigten. Die Mutanten der Caseinkinase Ialpha, Licorne, Tao und Metallophosphoesterase (MPPE) zeigten hingegen an der Phosphorylierungsstelle T864 eine verringerte Phosphorylierung. Die Nullmutante der Phosphatase Retinal Degeneration C (RDGC) zeigte eine drastisch verstärkte Phosphorylierung an der Phosphorylierungsstelle S936.
Von den identifizierten Kinase- und Phosphatasemutanten wiesen nur die Mutanten der Kinase ePKC und der Phosphatase RDGC bei ERG-Messungen Auffälligkeiten in Form einer bereits beschriebenen langsamen Deaktivierung der Lichtantwort auf. Zur Klärung der Frage, ob die veränderte Phosphorylierung des TRP-Kanals in den Mutanten der ePKC beziehungsweise der RDGC der Grund für die verlängerte Deaktivierung der Lichtantwort ist, wurden transgene Fliegen hergestellt, die modifizierte TRP-Kanäle exprimieren. Hierzu wurden die ePKC-abhängige Phosphorylierungsstelle T849 oder die RDGC-abhängige Phosphorylierungsstelle S936 des TRP-Kanals durch die Aminosäure Alanin oder Asparaginsäure ersetzt. Die biochemische Analyse dieser vier transgenen Fliegen offenbarte wildtypische Eigenschaften der modifizierten Kanäle in Bezug auf die subzelluläre Lokalisation, die Interaktion mit dem Gerüstprotein INAD, die Multimerisierung und die Expressionsrate. Elektrophysiologische Untersuchungen dieser transgenen Fliegen zeigten hingegen eine Verlängerung der Deaktivierungszeit im ERG sowohl durch den Austausch von T849 zu Alanin als auch durch den Austausch von S936 zu Asparaginsäure. Während der Austausch von Serin oder Threonin zu Alanin eine Phosphorylierung verhindert, wirkt der Austausch zu Asparaginsäure in der Regel phosphomimetisch. In der Wildtypsituation liegt T849 im Licht phosphoryliert und im Dunkeln dephosphoryliert vor, während bei S936 genau das Gegenteil der Fall ist. Die Aminosäureaustausche an den beiden Phosphorylierungsstellen ahmen also den Phosphorylierungszustand in dunkeladaptierten Wildtyp-Fliegen nach.
Zusammenfassend demonstrieren die Ergebnisse die Beteiligung von acht Kinasen und einer Phosphatase an der Einstellung des Phosphorylierungszustands des TRP-Kanals. Zwei der Phosphorylierungsstellen des TRP-Kanals vermitteln die schnelle Deaktivierung der Lichtantwort.
The phototransduction cascade in the eye of Drosophila melanogaster culminates in the opening of the ion channels TRP and TRPL. The hereby increased intracellular concentration of sodium and calcium ions underlies the formation of the photoreceptor potential. The TRP channel is subject to light-dependent phosphorylation. 15 of its phosphorylation sites exhibit increased phosphorylation upon illumination and one phosphorylation site exhibits increased phosphorylation in the dark. When this work was started, neither the function of light-dependent TRP phosphorylation nor the involved kinases and phosphatases were known.
Therefore, in the present work, kinases and phosphatases that affect the phosphorylation pattern of the TRP channel were identified. Towards this end a candidate screen of 79 kinase and phosphatase mutants was performed using three different phosphospecific antibodies. In this screen, eight kinases and one phosphatase were identified that affect the phosphorylation of one or more of the three tested phosphorylation sites. Eye-specific protein kinase C (ePKC) and protein kinase C 53E (PKC53E) mutants exhibited reduced phosphorylation at T849 of the TRP channel, while mutants of the Rolled kinase and the alpha-subunit of AMP-dependent kinase showed an increased phosphorylation at this site. The mutants of Casein kinase Ialpha, Licorne, Tao, and Metallophosphoesterase (MPPE) exhibited reduced phosphorylation of the site T864. The retinal degeneration C (RDGC) phosphatase null mutant demonstrated a dramatically increased phosphorylation at the phosphorylation site S936.
From these identified kinase and phosphatase mutants, only the mutants of the kinase ePKC and of the phosphatase RDGC displayed physiological abnormalities in terms of an already described slow deactivation of the light response in ERG measurements. To answer the question whether the altered phosphorylation of the TRP ion channel in the ePKC and RDGC mutants underlies the prolonged deactivation of the light response, transgenic flies were generated that express modified TRP channels. To this end, the ePKC-dependent TRP phosphorylation site T849 or the RDGC-dependent phosphorylation site S936 of the TRP channel were replaced by the amino acid alanine or aspartic acid. The biochemical analysis of these four transgenic flies revealed wild type characteristics of the modified channels with respect to subcellular localization, the interaction with the scaffold protein INAD, multimerization, and the expression rate. However, electrophysiological studies of these transgenic flies revealed a prolonged deactivation time when T849 was exchanged to alanine and in addition S936 was exchanged to aspartic acid. Whereas the exchange of a serine or threonine to alanine prevents phosphorylation, the exchange to aspartic acid typically mimics phosphorylation of this site. In the wild type situation, T849 is phosphorylated in the light and becomes dephosphorylated in the dark whereas for S936 the exact opposite is the case. The amino acid exchanges at the two phosphorylation sites thus mimic the phosphorylation pattern of dark-adapted wild type flies.
In summary, the results demonstrate the involvement of eight kinases and one phosphatase in generating of the phosphorylation pattern of the TRP ion channel. Two of the phosphorylation sites of the TRP ion channel mediate a rapid deactivation of the light response.
1465456254
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1215/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1215/pdf/DissJPB.pdf
Bartels, Jonas-Peter
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Physiologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:1216
2016-06-29T14:00:13Z
ddc:570
pub-type:8
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-12163
Hyperthermie steigert die Zytotoxizität von Cisplatin und Doxorubicin durch Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung und der damit einhergehenden Verhinderung der Replikationsblockade
Hyperthermia acts synergistically with cisplatin and doxorubicin by inhibition of a poly(ADP-ribosyl)ation-dependent replication arrest
Universität Hohenheim
Replikation
Hyperthermie
Eierstockkrebs
Colonkrebs
Chemotherapie
Life sciences
Hyperthermia
replication
chemotherapeutics
ovarian and colorectal cancer
Bei der Peritonealkarzinose handelt es sich um eine Metastasierung des Bauchfells (Peritoneum), die insbesondere von Ovarial- und Kolonkarzinomen im Laufe der Tumorprogression ausgeht. Lange Zeit galt diese weit fortgeschrittene Tumorerkrankung als extrem schwer therapierbar, sodass in der Regel nur palliativmedizinische Maßnahmen durchgeführt wurden. Dies hat sich in den letzten Jahren durch die Einführung multimodaler Behandlungsoptionen maßgeblich gewan-delt. Diese bestehen aus einer kompletten makroskopischen Tumorreduktion (CRS) gefolgt von einer intraoperativen, intraperitonealen hyperthermen Chemotherapie (HIPEC). Unbestritten ist, dass durch die lokal begrenzte Applikation wesentlich höhere Konzentrationen der Chemothera-peutika im Vergleich zur systemischen-Therapie verabreicht werden können. Der Stellenwert der Hyperthermie in diesem multimodalen Konzept ist bislang allerdings nicht eindeutig geklärt.
So existieren bis heute keine klinischen Studien, die einen Benefit der erhöhten Temperatur bei der intraperitonealen Chemotherapie (IP-Chemotherapie) eindeutig belegen. Weitgehend ungeklärt ist auch, welche Temperaturen für eine Zytotoxizitätssteigerung der Chemotherapie wirklich notwendig sind und welche molekularen Mechanismen einer solchen Effizienzsteigerung zugrunde liegen.
Um diese Fragen beantworten zu können wurde in vorliegender Arbeit zunächst ein in vitro-Modell etabliert, das die Situation der HIPEC-Prozedur möglichst exakt wiederspiegelt. Mit Hilfe dieses Modells gelang es, einen sehr präzisen Temperaturschwellenwert zu identifizieren, ab welchem eine effiziente Steigerung der Zytotoxizität von Cisplatin und Doxorubicin erzielt werden kann. Dieser Temperaturschwellenwert von 40°C ist auch von klinischer Relevanz. So weisen Patienten, die diese Temperatur an zwei Stellen im Bauchraum, nämlich Bursa omentalis und Pelvis, über mindestens 40 Minuten erreichten, ein signifikant erhöhtes Gesamt- und progressionsfreies Überleben auf.
In-vitro führt Hyperthermie zu einer gesteigerten intrazellulären Doxorubicin-Konzentration. Interessanterweise bleibt allerdings die Synergie von Hyperthermie mit Doxorubicin selbst dann erhalten, wenn die Doxorubicindosierung auf Werte reduziert wird, die auch bei 37°C erreicht werden. Zusammen mit dem Befund, dass Hyperthemie keinen Einfluss auf die Menge der DNA-Cisplatin-Addukte hat, weisen diese Ergebnisse sehr klar darauf hin, dass die erhöhte Zytostatika-Aufnahme nicht der prädominante Mechanismus hinter den Synergieeffekten von Zytostatika und Hyperthermie ist. Vielmehr konnte eine durch Hyperthermie kompromittierte DNA-Reparatur-kapazität sowohl nach Doxorubicin als auch nach Cisplatin gezeigt werden. Die signifikante Verzögerung der DNA-Reparatur konnte auf eine Hyperthermie bedingte Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung (PARylierung) zurückgeführt werden.
Interessanterweise kann durch Hyperthermie ausschließlich die Effizienz solcher Zytostatika gesteigert werden, die eine PARylierung induzieren. Die These, dass die Hemmung der PARylierung eine zentrale Rolle für die Synergie zwischen Hyperthermie und Chemotherapie darstellt, wird darüber hinaus durch den Befund gestützt, dass spezifische pharmakologische PARP-Inhibitoren zu vergleichbaren Zytotoxizitätssteigerungen von Cisplatin und Doxorubicin führen wie sie durch Hyperthermie erreicht werden. Insofern konnte die PARylierung als molekularer Marker für einen präklinischen Substanzscreen für HIPEC-Zytostatika identifiziert werden. Darüber hinaus zeigen diese in-vitro-Ergebnisse erstmals, dass es durchaus Alternativen zu der mit erheblichen Nebenwirkungen behafteten Hyperthermie-Behandlung gibt. So könnte eine intraperitoneale Chemotherapie mit einer systemischen Vorbehandlung der Patienten mit den sehr verträglicheren PARP-Inhibitoren kombiniert werden.
Die Hyperthermie-vermittelte Hemmung der PARylierung führt zu vermehrten DNA-Doppel-strangbrüchen (DSB), welche tendenziell im Vergleich zur normothermen Behandlung eher über das fehlerbehaftete NHEJ repariert werden. So kommt es durch die Kombination mit Hyperthermie in signifikant mehr Zellen zu einer P-53BP1-Foci-Formierung, während sowohl der prozentuale Anteil der Zellen mit RAD51-Foci als auch die Gesamt-RAD51-Proteinmenge unverändert bleibt. Der Befund, dass diese DSB ausschließlich in S-Phasen-Zellen auftreten, wies auf einen Replikations-assoziierten Mechanismus hin. Tatsächlich konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals gezeigt werden,dass die Zytostatika-induzierten Replikationsblockaden durch die Hyperthermie-vermittelte Hemmung der PARylierung aufgehoben werden. Das Resultat dieser ungehinderten Progression der Replikationsgabeln durch die Hemmung der PARylierung nach Hyperthermie oder pharmakologischer PARP-Inhibition ist dann vermutlich die beobachtete Zunahme der DNA-DSB sowie das signifikant reduzierte Langzeitüberleben.
Peritoneal carcinomatosis describes widespread metastases of cancerous tumors in the peritoneal cavity particularly arising from ovarian and colon cancers. For long time this far advanced tumor disease was considered extremely difficult to treat. Therefore, only palliative measures were carried out in most cases. This has changed significantly in recent years with the introduction of multimodal treatment options consisting of a complete macroscopic tumor reduction (CRS) followed by an intraoperative intraperitoneal hyperthermic chemotherapy (HIPEC). It is undisputed that this local chemotherapy application allows treatment with much higher drug concentrations as compared to the systemic therapy. However, the role of hyperthermia in this multimodal approach has not been fully clarified so far. There is still no clinical study available showing a clear benefit of elevated temperature in the intraperitoneal chemotherapy. Largely unknown is also which level of temperatures are really needed for an elevated cytotoxicity of chemotherapeutics. Furthermore, the molecular mechanisms behind this synergistic effect are poorly investigated.
To answer these questions, an in vitro model was established mimicking the situation of the HIPEC procedure as closely as possible. This model allowed to define a very precise temperature threshold of 40°C. An effective increase in cytotoxicity of cisplatin and doxorubicin was only observed at temperatures of 40°C or above. Importantly, this temperature threshold was also of clinical relevance. Patients who reached this temperature over at least 40 minutes at two sites in the abdominal cavity, namely omental bursa and pelvis, showed a significantly increased overall and progression free survival. In-vitro hyperthermia leads to an increased intracellular concentration of doxorubicin. Interestingly, however, the synergy of hyperthermia with doxorubicin was observed even after reducing the drug concentrations to values which are also reached at 37° C. Together with the finding that hyperthermia had no effect on the amount of DNA-cisplatin adducts, these results clearly indicate that the increased intracellular drug accumulation is not the predominant mechanism behind the synergistic effects of chemotherapeutics and hyperthermia. Rather a compromised repair of cisplatin and doxorubicin induced DNA damages upon hyperthermia treatment could be identified to be important for the observed
effects. This significantly delayed DNA repair depends on inhibition of the poly(ADR-ribosyl)ation (PARylation) by hyperthermia. Interestingly, hyperthermia selectively increased the efficiency of cytotoxic agents that induce PARylation. The hypothesis that inhibition of PARylation plays a key role for the synergy between hyperthermia and chemotherapy is further supported by the finding that the treatment with specific pharmacological PARP inhibitors resulted in a comparable elevation of cisplatin and doxorubicin induced cytotoxicity. In this respect PARylation could be identified as a molecular marker for a preclinical substance-screen to identify drugs acting together with hyperthermia. In addition, these in-vitro results for the first time show that there are alternatives to the hyperthermic treatment, which is associated with considerable side effects. Thus, intraperitoneal chemotherapy could be combined with systemic PARP inhibitor pre-treatment. Clinically approved specific PARP inhibitors are far better tolerated by patients than hyperthermia.
Hyperthermia mediated inhibition of PARylation led to an increase in the percentage of cells with DNA double-strand breaks (DSB). Interestingly, the results of this work indicate a hyperthermia-induced switch from HR to the error-prone NHEJ. In combination with hyperthermia there was a significant increase in P-53BP1 foci formation, while both the percentage of cells with Rad51 foci and Rad51 protein level remained unchanged. The finding that these DSBs occur only in S-phase cells points to a replication-associated mechanism. In fact, in the framework of this work it could be demonstrated for the first time that drug-induced stalled replication forks are circumvented by the hyperthermia-mediated inhibition of PARylation. The unhindered progression of replication forks upon inhibition of PARylation by hyperthermia or pharmacological PARP inhibition presumably results in the increase of DNA DSBs as well as in the significantly reduced long-term-survival
1466677246
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1216/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1216/pdf/Dissertation_Lea_Schaaf.pdf
Schaaf, Lea
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Zoologie
oai:opus.uni-hohenheim.de:1226
2016-07-04T14:04:57Z
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Bioinformatische Analyse und funktionelle Charakterisierung von strukturellen Genvarianten in ADME-Genen in humaner Leber
Bioinformatics analysis and functional characterization of structural variants in ADME genes in human liver
Universität Hohenheim
Pharmakogenetik
Kopienzahlvariation
Leber
Arzneimittel
Metabolismus
Phänotyp
Assoziation
Sequenzanalyse <Chemie>
Life sciences
Pharmakogenomik
dosis-abhängige
Expression
NGS
Exonsequenzierung
Pharmacogenetics
CNV
human liver
drug metabolism
exonsequencing
Die Pharmakogenetik beschreibt die Untersuchung von interindividuellen genetischen Unterschieden, welche die Wirkung von Medikamenten und die Reaktion auf xenobioti-sche Substanzen beeinflussen. Ein Großteil dieser Variabilität beruht auf Unterschieden im hepatischen Arzneimittelmetabolismus. Die daran beteiligten Enzyme, Transporter und Rezeptoren sind in die Prozesse der Absorption, der Distribution, des Metabolismus und der Exkretion involviert und werden als ADME-Gengruppe zusammengefasst. Neben den genetischen Faktoren können auch Einflüsse aus der Umwelt und endogene Faktoren, wie das Geschlecht, das Alter, Entzündungsreaktionen und andere Faktoren die Expression und die Aktivität der ADME-Gene ändern. Sind die Einflüsse so groß, dass das therapeutische Fenster eines Medikaments verlassen wird, kann das Ansprechen auf das Medikament ausbleiben oder unerwünschte Arzneimittelwirkungen und gegebenenfalls Toxizität können auftreten.
Das humane Genom eines bestimmten Individuums unterscheidet sich neuesten Daten zufolge im Vergleich zum Referenzgenom an 4,1 bis 5 Millionen Positionen. Davon sind mehr als 99,9% Einzelbasenpolymorphismen (single nucleotide polymorphism; SNP) oder kleine Insertionen und Deletionen. Daneben kommen bis zu 2.500 strukturelle Varianten pro Person vor, die insgesamt ca. 20 Millionen Basen einschließen und somit auf DNA-Basis mehr zur Variabilität des Genoms beitragen als die SNPs (1000 Genome Project, 2015). In der Gruppe der strukturellen Varianten finden sich auch Kopienzahlvariationen (copy number variations; CNV), per Definition mindestens 1kb lange duplizierte oder deletierte DNA Segmente. Beobachtungen zur Funktionalität der CNVs in der Fruchtfliege, der Maus und im Menschen fanden neben CNVs, die einen Einfluss auf den Phänotyp zeigten (dosis-sensitiv), auch CNVs, deren Einfluss umge-kehrt (dosis-umgekehrt) oder komplett abwesend war (dosis-insensitiv). CNVs, die den Arzneimittelmetabolismus beeinflussen, wurden zum Beispiel für das Phase I Gen CYP2D6 gezeigt. Eine verminderte oder erhöhte Kopienzahl des Gens wirkt sich direkt sowohl auf die mRNA und Proteinexpression, als auch auf die Enzymaktivität aus. So ist der Metabolismus der CYP2D6 Substrate Codein (Opioid) oder Tamoxifen (selekti-ver Östrogenrezeptormodulator) in Trägern dieser Varianten im Vergleich zu Trägern mit zwei Kopien signifikant verändert. Eine im Vorfeld durchgeführte Genotypisierung kann deswegen in Zukunft helfen, die Medikamentendosis Genotyp-abhängig anzu-passen.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Fragestellung, ob weitere ADME-Gene CNVs aufweisen und ob diese genetischen Varianten einen funktionellen Einfluss auf den Phänotyp und Arzneimittelmetabolismus haben.
Dazu wurde systematisch das Vorkommen von CNVs der wichtigsten ADME-Gene (n=340) in drei unabhängigen Datensätzen untersucht. In einer öffentlichen Datenbank für genomische strukturelle Varianten (DGV; dgv.tcag.ca) wurde die Position der AD-ME-Gene mit den dort beschriebenen CNV-Positionen aus HapMap-Proben abgegli-chen. Zusätzlich wurden in gesunden (n=269) und malignen (n=351) humanen Leber-proben des TCGA-Projektes (http://cancergenome.nih.gov/) prozessierte SNP-Mikrochipdaten ausgewertet. In einer am IKP Stuttgart etablierten Biobank (IKP148), die 150 Leberproben mit europäischer Herkunft und vollständiger klinischer und demo-graphischer Dokumentation umfasst, wurde mit Hilfe eines ADME-panelbasierten next generation Exonsequenzierungsprojektes (NGS) die Kopienzahl der 340 ADME-Gene detektiert. Dafür wurde eine Methode entwickelt und ein bioinformatischer Arbeitsablauf angewendet, der die Abdeckung der einzelnen Sequenzierungen auswertet und daraus die relative Kopienzahl für jedes Gen und Exon bestimmt. Die Ergebnisse wurden mittels real time PCR und spezifischen TaqMan CNV-Assays validiert. Für die funktionelle Assoziationsanalyse wurde in 50 gesunden TCGA-Leberproben auf Gen-expressionswerte einer RNA-Sequenzierung zurückgegriffen. In lymphoblastoiden Zell-linien der HapMap-Proben (LCL) und den IKP148-Leberproben wurden normalisierte Intensitäten eines Expressionsmikrochips zur funktionellen Analyse verwendet. Zusätz-lich lagen in den Leberproben (IKP148) bereits Protein und Enzymaktivitätsdaten für einzelne ADME-Gene vor. Weitere Proteinexpressionsdaten wurden mit WesternBlot Analysen bestimmt.
Mit diesem systematischen Ansatz konnten alle bekannten, pharmakologisch wichtigen CNVs in Phase I und II Genen, wie CYP2A6, CYP2D6, GSTM1, GSTT1, SULT1A1 und UGT2B17 in allen untersuchten Datensätzen bestätigt werden. Weitere CNVs, die teil-weise bereits bekannt waren oder noch nicht als funktionell beschrieben wurden, fan-den sich ebenfalls in der Phase I und II Gruppe, wie CES1, CYP2E1, CYP21A2, UGT2B15 und UGT2B28. Seltene CNVs (<1%) betrafen überwiegend Transporterge-ne, wie zum Beispiel ABCA2, SLC2A4 und SLC47A1. Zudem wurden in den Leberpro-ben (IKP148) mit der NGS-Methode CYP2A6 und CYP2D6 CNVs feinkartiert. Mit einer Auflösung auf Exonebene wurden Hybridallele der beiden Gene mit dem jeweiligen Pseudogen festgestellt und bestätigt. Auch die funktionelle Analyse bestätigte die posi-tive Assoziation von CNVs der Gene CYP2A6, CYP2D6, GSTM1, GSTT1, SULT1A1 und UGT2B17 mit der mRNA Expression in allen drei Kohorten. In den IKP148-Leberproben wurde mit der Kombination aller genetischen Informationen aus dem ADME-panelbasierten NGS-Datensatz gezeigt, dass die genetischen Faktoren 11% bzw. 53% der Variabilität der CYP2A6 und CYP2D6 Enzymaktivität erklären.
Im Gegensatz dazu war die mRNA Expression der Gene CES1 oder CYP2E1 in ge-sundem Lebergewebe (IKP148 und TCGA) und in den LCLs nicht von der Kopienzahl abhängig. Eine detailliertere Analyse des CYP2E1 Gens und der detektierten CNVs mit der Proteinexpression und Enzymaktivität bestätigte die Unabhängigkeit von der Gen-dosis in den IKP148-Leberproben. Diese Dosiskompensation kann prinzipiell durch verschiedene Mechanismen erklärt werden. Neben gewebe- und tumorspezifischen Faktoren könnten gelinkte genetische Varianten, eine starke posttranskriptionelle und posttranslationale Regulation wie z.B. mit Hilfe von miRNAs, ein unvollständiger Ein-schluss der regulatorischen und kodierenden Sequenzen in der strukturellen Variante, Hybridgene, eine monoallelische Expression, negative Rückkopplung oder epigeneti-sche Faktoren für das Ausbleiben des CNV-Effektes verantwortlich sein. In dieser Ar-beit wurde mittels einer Haplotypanalyse in der CYP2E1 Region SNPs identifiziert, die mit der Genduplikation gelinkt waren und tendenziell die Expression in Individuen mit europäischer Herkunft negativ beeinflussten. Mit in silico Methoden wurde eine Bezie-hung zwischen einem der zur Duplikation gelinkten SNPs in der 3UTR mit zusätzlichen miRNA Bindestellen vorhergesagt. Die daran bindenden miRNAs sind möglicherweise für die Regulation zusätzlicher Kopien verantwortlich.
Der Einfluss von CNVs auf die mRNA Expression anderer Gene, wie CYP21A2, UGT2B25 und UGT2B28, war inkonsistent. Obwohl CYP21A2 Deletionen mit einem verminderten Expressionsphänotyp assoziiert waren, zeigten Duplikationen keinen Einfluss (IKP148). Eine Assoziation von UGT2B28 CNVs wurde nur in LCLs nicht aber in Lebergewebe (IKP148 und TCGA) gefunden. Insgesamt wurde in den IKP148-Proben in 7 von 17 Genen, in den TCGA-Leberproben in 2 von 12 und in den LCLs in 3 von 14 Genen ein Einfluss der CNVs auf die Expression gefunden. Im TCGA-Krebsgewebe waren nahezu alle 340 ADME-Gene von CNVs betroffen und mehr als 30% der CNVs zeigten einen signifikanten Effekt auf die mRNA Expression.
Im Rahmen von Kooperationsprojekten wurden weitere Polymorphismen und Phänoty-pen von CYP2E1 und SULT1A1 analysiert.
CYP2E1: Dieser Teil der Arbeit befasst sich mit Faktoren, die das Risiko einer Erkran-kung an Schilddrüsenkrebs (differentiated thyroid carcinoma; DTC) verändern. Es ist bekannt, dass die Progression von DTC durch das Zusammenspiel von genetischen Faktoren, Umwelteinflüssen, wie ionisierende Strahlung, vorhergegangene Erkrankun-gen der Schilddrüse und unnatürliche Hormonspiegel, beeinflusst wird. Acrylamid, das mit der Nahrung aufgenommen wird, gilt als potentieller neuer Faktor in der DTC Ent-stehung. Da Acrylamid von CYP2E1 zum karzinogenen Glycidamid metabolisiert wird und diese Reaktion vermutlich abhängig vom CYP2E1 Genotyp ist, wurde untersucht, ob Varianten von CYP2E1 das DTC Risiko beeinflussen können. Dafür wurde in einer Fall-Kontroll-Studie eines Kooperationspartners (Prof. Dr. Stefano Landi, Universität von Pisa, Pisa, Italien) ein Tag-SNP Verfahren gewählt und der SNP rs2480258, der Varianten im Intron acht und der 3UTR von CYP2E1 abdeckt, als Risiko SNP identifi-ziert. Anschließend wurde untersucht, ob der Tag-SNP die Expression und Aktivität von CYP2E1 in humanem Gewebe beeinflusst. Dazu wurden in den Leberproben (IKP148) die Genotypen des tag-SNP durch ein Imputierungsverfahren bestimmt und mit den CYP2E1 Phänotypen korreliert. Es zeigte sich, dass das A Allel des tag-SNPs, welches mit einem höheren DTC-Risiko assoziiert war, die mRNA, die Proteinexpression und die Enzymaktivität reduziert. Eine in silico Analyse zum möglichen molekularen Mechanismus prognostizierte, dass eine miRNA (miR570) die CYP2E1 Transkripte in Trägern des A Allels reduziert. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die interindi-viduelle CYP2E1 Aktivität sowie Acrylamid (ähnlich dem Glycidamid) das Risiko für die Entstehung von DTC beeinflussen.
SULT1A1: Methyleugenol, ein Sekundärmetabolit aus Kräutern wie Lorbeer und Basili-kum, wird im humanen Organismus über eine Sulfatierung zu einem reaktiven Metabo-liten aktiviert, welcher DNA kovalent binden kann. Die entstehenden DNA-Addukte sind mutagen und können bei ineffektiver DNA-Reparatur ein Auslöser von Karzinogenese sein. In Mäusen wurde von einem Kooperationspartner (Prof. Dr. Hans-Rudolf Glatt, Deutschen Institut für Ernährungsforschung Potsdam-Rehbrücke (DIfE), Nuthetal, Deutschland) bereits gezeigt, dass der Metabolismus in der Leber abläuft und haupt-sächlich das Phase II Enzym SULT1A1 daran beteiligt ist. Um diese Ergebnisse in hu-manen Proben nachzuvollziehen, wurden vom Kooperationspartner in 121 der 150 Leberproben (IKP148) die Methyleugenol DNA-Adduktspiegel gemessen. In dieser Arbeit wurde zusätzlich die SULT1A1 Proteinmenge in den IKP148-Leberproben be-stimmt. Die SULT1A1 mRNA und Proteinexpression korrelierten jeweils signifikant mit den DNA-Adduktmessungen, d.h. je höher die SULT1A1 Expression, desto höher wa-ren die Adduktspiegel. Dies bestätigte in humanen Leberproben die in vivo Rolle von SULT1A1 im Methyleugenolmetabolismus. Wie oben bereits angedeutet, kamen in den Leberproben Träger von ein, zwei, drei, vier und fünf SULT1A1 Genkopien vor. Dabei waren Deletionen seltener (4%) als Duplikationen (36%) zu beobachten. Die Kopienzahl korrelierte signifikant mit der SULT1A1 mRNA und Proteinexpression. Diese Er-gebnisse sind in Einklang zu früheren Studien, die einen Effekt der Kopienzahl auf die Enzymaktivität aufzeigten. Die Methyleugenol DNA-Adduktspiegel waren ebenfalls zur SULT1A1 Kopienzahl assoziiert. Träger von mehr als drei Genkopien hatten ein 2,8-fach höheres DNA-Adduktlevel als Träger mit nur einer SULT1A1 Genkopie. Träger mehrerer SULT1A1 Kopien können daher unter Umständen leichter, schneller und öfter ein kritisches DNA-Adduktlevel erreichen, das zu einem höheren Krebsrisiko führen kann. Weiterführende Fall-Kontroll-Studien sollten daher, neben der Menge an aufge-nommenem Methyleugenol, die SULT1A1 Kopienzahl berücksichtigen.
Pharmacogenetics is the study about inter-individual genetic variation that influences the response to drugs and other xenobiotics. A major part of this variation is due to hepatic drug metabolism with enzymes, transporters and receptors involved in the ab-sorption, distribution, metabolism and the excretion of drugs, xenobiotics and endoge-nous substances and collectively defined as ADME-genes. Genetic factors along with environmental and endogenous factors, including gender, age, inflammation processes and others are known to influence the expression and activity of ADME-genes. These influences can affect drug response, side effects or toxicity.
According to newly published data, the human genome of any subject differs from a reference genome at 4.1 to 5.0 million positions. More than 99.9% of these differences are single nucleotide polymorphisms (SNP) or short insertions or deletions. Further-more, a person carries up to 2,500 structural variants, including copy number variations (CNV) affecting ~20 million bases (1000 Genomes Project Consortium et al., 2015). Thus structural variants affect more bases than SNPs. Per definition the CNVs are du-plicated or deleted DNA segments greater than 1kb and it was shown that they cover at least 12-30% of the human genome. Genome-wide studies investigating the function-ality of CNVs in the fruit fly, the mouse and in humans showed that there are genes whose expression is clearly affected by CNVs (dosage-sensitve), but also genes show-ing lower expression with increased copy number (dosage reversed) or genes without any expression alterations despite different copy number (dosage-insensitive).
A prominent example of CNVs influencing drug metabolism is the phase I gene CYP2D6. Carriers of reduced or amplified gene copies show significantly altered ex-pression and enzyme activity levels and also a different drug metabolism of substrates like codeine (opioid) or tamoxifen (selective estrogen receptor antagonist) in compari-son to carriers with normal copy status of two. Genotyping of CYP2D6 gene copy num-ber may thus help to adjust drug dosage in a genotype dependent manner. In this work I investigated if further ADME-genes are affected by CNVs and if these variants have a functional impact on the expression phenotype and drug metabolism.
The distribution of CNVs in the most important ADME-genes (n=340) was investigated in three independent cohorts using CNV data in a public accessible database of ge-nomic variants (DGV; dgv.tcag.ca), processed SNP microarray data of paired samples of healthy (n=269) and tumor (n=351) liver tissue of the TCGA project (http://cancergenome.nih.gov/) and ADME-panel based exon next generation sequenc-ing (NGS) applied on 150 well documented human liver samples of an in-house cohort (IKP148). For the NGS data analysis a method was developed and optimized to esti-mate the relative copy number of the ADME genes or every single exon via the read depth. The results were validated using qPCR with specific TaqMan assays. RNA-sequencing data of 50 healthy TCGA liver samples, and normalised expression data from microarray experiments applied to lymphoblastoid cell lines (LCL) from the HapMap samples and the 150 human liver samples (IKP148) were used to analyse the association between CNVs and the mRNA expression. Furthermore, in the IKP148 liver samples protein and enzymatic activity levels were available or measured using West-ernBlot and mass spectrometry for selected ADME-genes.
All pharmacologically important CNVs of phase I and phase II genes, including CYP2A6, CYP2D6, GSTM1, GSTT1, SULT1A1 and UGT2B17 could be confirmed in all datasets. CNVs which were known, but so far not functionally assessed were found in the phase I and II genes CES1, CYP2E1, CYP21A2, UGT2B15 and UGT2B28. In this work rare CNVs (<1%) were mainly found for transporters like ABCA2, SLC2A4 and SLC47A1. The analysis of the read depth in the IKP148 samples data revealed hybrid genes for CYP2A6 and CYP2D6 with their pseudogenes and allowed a fine mapping of the different alleles. The functional analysis further confirmed the positive association between CNVs and the mRNA expression of CYP2A6, CYP2D6, GSTM1, GSTT1, SULT1A1 and UGT2B17 in all three cohorts. The combination of all data from the NGS project in the IKP148 liver subjects, including SNP and CNV genotypes showed that 11% and 53% of the variability of CYP2A6 and CYP2D6 enzyme activity were explained by the genetic factors.
In contrast the mRNA expression of the genes CES1 and CYP2E1 was not dependent of the CNV pattern in healthy liver tissue (IKP148 and TCGA) and lymphoblastoid cell lines. A detailed analysis of the protein and enzyme activity levels (chlorzoxazone-6-hydroxylation) of CYP2E1 confirmed the dosage-insensitivity in the IKP148 liver sub-jects. The dosage compensation can be principally explained by different mechanisms and could be tissue or tumor specific. Furthermore, CNV-linked genetic variants, altered miRNA regulation, incomplete inclusion of regulatory elements or coding sequences, hybridgenes, monoallelic expression, feedback loops or epigenetics could be factors which mask the CNV effect. In this work a haplotype analysis of the CYP2E1 region identified SNPs which were linked to the duplication and a reduced expression phenotype in persons with European ancestry. Using in silico prediction tools we found a relation of one of the linked SNPs in the 3UTR with additional predicted miRNA bind-ing sites potentially regulating additional CYP2E1 gene copies.
The CNV influence on the mRNA expression of the genes CYP21A2, UGT2B25 and UGT2B28 was inconsistent. Although CYP21A2 deletions were associated with a de-creased expression, gene duplications showed normal expression levels compared to samples with two copies. A significant influence of UGT2B28 CNVs was found in LCLs but not in human liver samples (IKP148 and TCGA). In total 7 of 17, 2 of 12 and 3 of 14 ADME genes showed a significant association between expression and CNV type in the IKP148, TCGA and LCLs of the HapMap samples, respectively. In the TCGA cancer tissue nearly all ADME-genes carry CNVs and in 30% of the genes a significant correlation was observed.
With cooperation partners further polymorphisms and phenotypes of SULT1A1 and CYP2E1 were analyzed.
CYP2E1: In this part of the thesis factors influencing the risk of developing differentiat-ed thyroid carcinoma (DTC) were investigated. Known risk factors for the progression of DTC are genetic and environmental factors, including ionizing radiations, previous thyroid diseases, and hormone factors. It has been speculated that dietary acrylamide intake correlates with the DTC formation. The acrylamide molecule is metabolized by CYP2E1 to the reactive carcinogenic glycidamide. The enzymatic reaction is probably dependent on the CYP2E1 genotype. Together with a cooperation partner (Prof. Dr. Landi, University of Pisa, Pisa, Italy) we investigated, whether CYP2E1 variants influ-ence the DTC risk. Prof. Landi and colleagues used a case-control-cohort and a haplo-type approach and observed a significant association between a tag-SNP rs2480258 (A allele), which covers variants in intron eight and the 3UTR, and an increased DTC risk. In the human liver samples (IKP148) the rs2480258 genotypes were assessed using an imputation analysis and it was shown that particularly the A allele of the SNP reduce significantly the mRNA and protein expression and the enzyme activity. An in silico prediction for the molecular mechanism suggested that miR570 specifically down regulates the transcripts in carriers of the A allele. These results indicated that the inter-individual CYP2E1 activity as well as acrylamide (similar to glycidamide) influences the risk for DTC.
SULT1A1: Methyleugenol, a secondary metabolite present in herbs such as basil or laurel is metabolized in humans by sulfation to a reactive product which can covalently bind to DNA. The resulting DNA adducts are mutagenic and can promote carcinogene-sis. Our cooperation partner Prof. Dr. Hans-Rudolf Glatt (German Institute for Human Nutrition Potsdam-Rehbruecke (DIfE), Nuthetal, Germany) had shown, that the meth-yleugenol metabolism takes place in the liver of mice and is mainly catalyzed by the phase II enzyme SULT1A1. To investigate these facts in humans, the methyleugenol DNA-adduct levels were measured by the cooperation partner in liver tissues (n=121; IKP148) using mass spectrometry. In this work the SULT1A1 protein levels were de-termined using western blot analysis and the relation between the DNA adducts as well as the SULT1A1 expression and the SULT1A1 CNVs was assessed. The SULT1A1 mRNA and protein expression were significantly correlated to the DNA adducts, e.g. higher SULT1A1 expression resulted in higher adduct levels. This emphasized the role of SULT1A1 in the in vivo metabolism in human liver samples. As mentioned above, there were individuals (IKP148) carrying one, two, three, four and five copies of SULT1A1. Deletions were found less frequent (4%) than duplications (36%). The CNVs were significantly associated with the SULT1A1 mRNA and protein expression. This result was consistent to previous studies investigating the association between SULT1A1 CNVs and enzyme activity. The methyleugenol DNA adduct levels were also significantly associated to the SULT1A1 copy number. Carriers of at least three gene copies exhibited a 2.8-fold higher DNA adduct level compared to donors carrying only one SULT1A1 gene copy. As a consequence this could mean that individuals with mul-tiple SULT1A1 copies reach faster, more often and more easily critical and ultimate adduct levels which increase the risk for developing cancer. Future studies should clari-fy whether methyleugenol intake as well as the individual SULT1A1 CNV make-up in-fluences the risk of cancer.
1467633897
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1226/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1226/pdf/Diss_RTremmel.pdf
Tremmel, Roman
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Biologische Chemie und Ernährungswissenschaft
oai:opus.uni-hohenheim.de:1245
2016-07-25T08:46:14Z
ddc:570
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Agrogentechnik und Biotechpflanzenproduktion : Entwicklung, Stand und Zukunftspotential
Universität Hohenheim
Biotechnologie
Gentechnologie
Pflanzenproduktion
Agrarproduktion
Mais
Raps
Soja
Zuckerrübe
Baumwolle
Life sciences
Agrogentechnik
Biotechpflanzenproduktion
genetische Selektion
Pflanzen sind die Nahrungsgrundlage für Mensch und Tier und werden es bleiben. Was unverfälschte Natur zu bieten hat, konnte nie befriedigen, doch war ein langer, weit in die vorchristliche Zeit zurückreichender Weg zurückzulegen, um von essbaren Wildpflanzen und einfachen Landrassen zu den heutigen Hochleistungssorten bei Getreide, Soja, Raps und anderen zu gelangen. Auch heute ist das Potential der klassischen Pflanzenzüchtung noch keineswegs erschöpft. Genomsequenzierung, auf molekulare Marker gestützte Identifizierung züchterisch wertvoller Merkmale und andere früher unbekannte Methoden können Züchtungsprogramme vereinfachen und die Sortenentwicklung beschleunigen. Es bleibt aber eine prinzipielle Schranke, welche die konventionelle Pflanzenzüchtung von wenigen Ausnahmen abgesehen nicht überwinden kann: Sie kann die Artgrenzen nicht überspringen und bleibt auf die Nutzung des arteigenen Genvorrats angewiesen. Das änderte sich um 1985, als es erstmals gelang, bakterielle Gene in dafür gut geeignete Modellpflanzen wie den Tabak einzuführen und zwar so, dass sie exprimiert wurden, d. h. ein funktionelles Proteinprodukt lieferten und sich stabil an die sexuellen Nachkommen dieser ersten transgenen Pflanzen vererbten. Zehn Jahre später begann der kommerzielle Anbau von herbizidresistentem und wenig später insektenresistentem Mais in den USA und Kanada. Es war die Geburtsstunde der Agrogentechnik. Heute werden transgene Kulturpflanzen dort, wo ihre prinzipiellen Gegner weniger Einfluss haben als hierzulande, auf mehr als 180 Millionen ha Ackerland angebaut. Mehr als eine Milliarde Menschen und ein Mehrfaches an Nutztieren haben sich bis heute von Genpflanzen und daraus hergestellten Nahrungs- und Futtermitteln ernährt.
Der Grund für den Erfolg der neuen Technik liegt darin, dass sie messbare wirtschaftliche und ökologische Vorzüge hat, die sich in niedrigeren Umweltbelastungen, höheren Erträgen und deutlichen Einkommensverbesserungen der landwirtschaftlichen Betriebe niederschlagen. Während man die Vorteile der Agrogentechnik heute leicht erkennen kann, sind die ihr zugeschriebenen Risiken spekulativ geblieben. Es gibt weder zwingende theoretische Argumente noch praktische Erfahrungen, die dazu berechtigen, der gentechnischen Pflanzenzüchtung ein gegenüber traditionellen Verfahren größeres Gefahrenpotential zuzuschreiben. Ihre realisierbaren Anwendungen gehen über den gegenwärtig noch dominierenden Anbau herbizid- und insektenresistenter Ackerpflanzen weit hinaus. Sie umfassen Nahrungspflanzen mit erhöhter Krankheitsresistenz, verbesserter Trockentoleranz, besserer Verträglichkeit aus ihnen hergestellter Lebensmittel, ausgeglichenem Gehalt an Aminosäuren, Vitaminen und Spurenelementen ebenso wie Industriepflanzen zur Produktion von Grund- und Wirkstoffen für die Chemie- und Pharmaindustrie. An diesen Entwicklungen arbeiten öffentliche und private Forschungseinrichtungen überall in der Welt. Der Mangel an nutzbarem Ackerland, Trinkwasser und sich abzeichnende Folgen des Klimawandels für die Landwirtschaft erzeugen einen wachsenden Druck zur möglichst wirkungsvollen Nutzung aller verfügbaren Ressourcen. Zwar kann die Agrogentechnik das Welternährungsproblem ebensowenig dauerhaft lösen wie irgendeine andere Technik, solange das exponentielle Wachstum der Erdbevölkerung nicht zum Stillstand kommt. Sie vermag aber die Folgen der Übervölkerung abzumildern; denn sie leistet einen wesentlichen Beitrag zur Verbesserung der Grundversorgung und zu einer effizienteren, die Naturvorräte schonenden Landwirtschaft. Die Verdrängung der konventionellen Sorten durch transgene wird deshalb weitergehen. Transgene Ackerpflanzen der ersten Generation, die überwiegend nur ein transgenes Merkmal tragen, werden gegenwärtig rasch durch modernere Stapelsorten ersetzt, die zwei oder mehrere Transgene exprimieren. Sie sind oft herbizidtolerant und gleichzeitig gegen alle wichtigen Schädlinge resistent, die in den jeweiligen Anbaugebieten vorkommen. Gleichzeitig kommen immer mehr Sorten auf den Markt, die nicht nur für die Produzenten Vorteile haben sondern auch ernährungsphysiologisch wertvoller sind als ihre konventionellen Vorläufer. Am Ende dieser Entwicklung werden die konventionellen Sorten auf dem Agrarweltmarkt kaum noch eine Rolle spielen.
Dieses Buch behandelt Geschichte, Methoden, Entwicklungsstand und Zukunftspotential der Agrogentechnik, beschreibt typische Vertreter dieses Kulturpflanzentyps und gibt anhand ausgewählter noch im Versuchsstadium stehender Prototypen einen Ausblick auf die kommende Entwicklung und ihre absehbaren Auswirkungen auf die Tier- und Pflanzenproduktion.
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ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1245/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1245/pdf/Agrogentechnik.pdf
Kuhn, Ekkehard
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen
oai:opus.uni-hohenheim.de:1253
2016-08-24T07:35:58Z
ddc:570
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urn:nbn:de:bsz:100-opus-12539
GLUT-1 content and interaction with stomatin in red blood cells from species without vitamin C biosynthesis and their relevance for diabetes mellitus type 1
Universität Hohenheim
Vitamin C
Diabetes mellitus
Erythrozyt
Life sciences
Glut-1
Stomatin
Detergenzien resistente Membranen
Diabetes mellitus
Erythrozyten
Glut-1
Stomatin
detergent resistant membranes
diabetes mellitus
red blood cells
Ascorbic acid is commonly known as vitamin C. By definition, vitamins, with the exception of vitamin D, are substances which can not be synthesized, but are essential for the organism. In this light, vitamin C is special.
It is hypothesized that millions of years ago some species, like primates, Guinea pigs and fruit bats, lost the ability to synthesize ascorbate from glucose due to an inactivation of an enzyme called L-gulono-g-lactone oxidase. Since then, these species have been dependent on dietary intake of this micronutrient. Ascorbate is not only the most efficient watersoluble antioxidant, but also an important cofactor in neurotransmitter or collagen biosynthesis. An inadequate intake of this vitamin leads to scurvy.
In 2008, a French researcher documented that all species that lost the ability to synthesize ascorbic acid express a different facilitative glucose transporter isoform(GLUT) in their erythrocytes. The expressed GLUT-1 transports not only glucose but also dehydroascorbate which is the oxidized form of vitamin C. Was that different GLUT expression the keystone event for the evolutionary success of these species?
To examine the questions regarding the evolutionary benefit of this transporter expression, the kinetics of ascorbate and dehydroascorbate transport into erythrocytes from four different species were evaluated. Further, recycling and disposal of the transported vitamin as well as a possible accumulation were observed.
The results demonstrate that there are three different transport types of dehydroascorbate. One which does not transport the vitamin at all, one whose transport of dehydroascorbate competes with glucose and one which absorbs dehydroascorbate completely independent of the extracellular glucose concentration. After absorption, vitamin C is not recycled and is not disposed back into the extracellular fluid. Additionally, it is not stored in the cell until the erythrocyte undergoes apoptosis. The evolutionary benefit is found in an electron transfer across the erythrocyte membrane from intracellular ascorbate to the extracellular, oxidized form of vitamin C. In an energetic light, this recycling of extracellular vitamin C is more efficient than the de novo synthesis of the micronutrient. Therefore, the erythrocyte acts not as a reservoir for vitamin C storage, but as a reservoir for electron storage to prevent degradation and loss of dehydroascorbate in times of high oxidative stress. This electron reservoir becomes more important in diseases with high levels of oxidative stress.
A metabolic disorder, which is frequently described to be accompanied by high levels of oxidative stress and lowered vitamin C levels in plasma and cells, is Diabetes mellitus. The decreased plasma concentrations do not result from a smaller dietary intake. Probably, the uptake of dehydroascorbate into erythrocytes, and, therefore, the extracellular ascorbate recycling is disordered. Investigations of the distribution of GLUT-1 in different erythrocyte membrane subdomains showed that the regulation of this transporter is altered in subjects with diabetes mellitus type 1 compared to healthy controls. In vitro, no differences in dehydroascorbate transport rate could be observed, but significantly decreased intra-erythrocyte vitamin C concentrations were detected in vivo.
In conclusion, the altered regulation of GLUT-1 in the erythrocyte membrane in the case of diabetes can affect vitamin C recycling in plasma. A decreased ascorbate pool in the cells leads to a decreased recycling capacity, and, therefore, to a lower antioxidant defense outside the cell. Due to that knowledge, the recommended dietary intake of vitamin C in the case of diabetes mellitus must be reconsidered to prevent further complications.
Ascorbinsäure ist allgemein bekannt unter dem Begriff Vitamin C. Per Definition sind Vitamine, mit der Ausnahme von Vitamin D, Substanzen, die ein Organismus nicht selbst synthetisieren kann, aber die für sein Überleben essentiell sind. In diesem Fall ist Vitamin C etwas Besonderes.
Vor vielen Millionen Jahren verloren einige Arten von Lebewesen, wie Primaten, Meerschweinchen und Flughunde, die Fähigkeit Ascorbinsäure aus Glukose zu bilden. Auslöser hierfür war eine genetische Mutation, die zu einem inaktiven Enzym namens L-Gulono-g-Lacton Oxidase führte. Von diesem Zeitpunkt an waren genannte Arten auf die Zufuhr dieses Mikronährstoffes mit der Nahrung angewiesen.
Ascorbat ist nicht nur ein äußerst effektives, wasserlößliches Antioxidans, sondern auch ein wichtiger Kofaktor bei der Herstellung von Neurotransmittern und Kollagen. Eine unzureichende Zufuhr führt zu der typischen Mangelerscheinung von Vitamin C, genannt Skorbut.
Im Jahr 2008 konnte eine französische Forscherin zeigen, dass alle Arten, die die Fähigkeit zur Vitamin C Synthese verloren hatten, einen anderen Glukosetransporter(GLUT) in ihren Erythrozyten besaßen. Dieser Transporter, GLUT-1, transportiert nicht nur Glukose, sondern auch die oxidierte Form von Vitamin C, Dehydroascorbat. War diese veränderte Expression einer Transporter Isoform das Schlüsselereignis für das Überleben dieser Arten?
Um die Frage des evolutionären Vorteils dieser GLUT-1 Expression zu erörtern, wurde die Aufnahme von Ascorbat und Dehydroascorbat in Erythrozyten von vier verschiedenen Arten analysiert. Weiterführend wurden ein intrazelluläres Recycling mit anschließender Disposition sowie eine mögliche lebenslange Akkumulation von Vitamin C untersucht.
Die Ergebnisse konnten drei verschiedene Isoformen des Glukosetransporters identifizieren. Eine, die kein Vitamin C, sondern nur Glukose transportiert, in der zweiten ist eine Konkurrenz zwischen Dehydroascorbat und Glukose deutlich ersichtlich und in der dritten Form ist die Dehydroascorbat-Aufnahme nicht von Glukose beeinflussbar. Im Anschluss an die Aufnahme wird Dehydroascorbat zwar reduziert, aber nicht wieder in die extrazelluläre Flüssigkeit entsandt. Ebenso wird es nicht bis zum Zelltod angereichert. Der evolutionäre Vorteil der Dehydroascorbat-Aufnahme besteht in einem Elektronenfluss über die erythrozytäre Membran von intrazellulärem Ascorbat zu den extrazellulär lokalisierten, oxidierten Formen des Vitamins. Dieses Recycling von extrazellulärem Vitamin C ist energetisch effizienter als die de novo Synthese des Vitamins. Der Erythrozyt ist daher kein Speicher für Vitamin C, sondern ein Reservoir für Elektronen, die in Zeiten erhöhten oxidativen Stresses extrazelluläres Vitamin C durch Reduktion vor der Selbstzerstörung und der Ausscheidung schützen. Dieses Reservoir für Elektronen gewinnt in Erkrankungen an Relevanz, in denen vermehrt oxidativer Stress entsteht.
Diabetes mellitus ist eine Erkrankung des Zuckerstoffwechsels, die oft mit erhöhtem oxiativen Stress und verminderten Vitamin C-Spiegeln in Plasma und Zellen einhergeht. Diese verminderten Konzentrationen resultieren hierbei nicht von einer inadäquaten Zufuhr des Mikronährstoffes mit der Nahrung. Möglicherweise ist die Aufnahme von Dehydroascorbat in die Erythrozyten gestört, so dass weniger Elektronen für das Recycling von extrazellulärem Vitamin C bereitgestellt werden können.
Untersuchungen einer Verteilung von GLUT-1 zwischen verschiedenen Membranabschnitten im Erythrozyt zeigten, dass die Regulation des Transporters bei Patienten mit Diabetes verändert ist. In vitro resultierten keine Unterschiede im Transportverhalten von dieser veränderten Verteilung des Transporters. In vivo wurden jedoch signifikant verminderte Vitamin C Konzentrationen in Erythrozyten von Personen mit Diabetes beobachtet. Schlussendlich beeinflussen die gefunden Unterschiede in der GLUT-1 Distribution das Vitamin C Recycling im Plasma. Ein verminderter Gehalt an Vitamin C in den Erythrozyten führt zu einer schlechteren Reduktion von extrazellulärem Vitamin C und damit zu einem geringeren antioxidativen Schutz. Mit diesen neuen Erkenntnissen ist es nötig die Zufuhrempfehlungen für Patienten mit Diabetes noch einmal zu überdenken, um Ihnen einen optimalen Schutz vor oxidativem Stress und damit verbundenen Folgeerkrankungen zu gewährleisten.
1471944518
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1253/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1253/pdf/Dissertation_Tabea_Frey.pdf
Frey, Tabea Caroline
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Biologische Chemie und Ernährungswissenschaft
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2016-10-31T14:12:27Z
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Untersuchung einer Methode zur spezifischen Fluoreszenz Markierung von Signalproteinen und deren Beobachtung in lebenden Escherichia coli (Einzelmolekültechnik & Perspektiven)
Investigation of a method for specific fluorescence - labeling of signaling proteins and their observation in living Escherichia coli (Single-molecule technology and perspectives)
Universität Hohenheim
Chemotaxis
Fluoreszenz
Fluoreszenzmarkierung
Life sciences
BG-Farbstoffe
Chemotaxis
Fluoreszenzmarkierung
SNAP-tag
TIRF-Mikroskopie
BG-dyes
chemotaxis
fluorescence
labeling
SNAP-tag
TIRF-microscopy
Störungen in der Signaltransduktion sind häufig die Ursache für Erkrankungen wie Krebs und Stoffwechselstörungen. Ein detailliertes Verständnis der relevanten Mecha-nismen der Signalübermittlung ist daher eine wichtige Voraussetzung für die Entwick-lung von Therapien und die Herstellung von Medikamenten. In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die es erlaubt einzelne Signalproteine und deren Interaktionen in der lebenden Zelle zu beobachten, im Gegensatz zu molekularbiologischen Nachweis-verfahren, welche auf Ensemblemittelwerten beruhen. Als Modellsystem für die Signal-transduktion wurde die bakterielle Chemotaxis mit seinem Regulatorprotein CheY aus-gewählt. Die Untersuchungen wurden mit der Internen Totalreflektions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) durchgeführt, welche eine fluoreszente Markierung der zu untersuchenden Moleküle erfordert. Um eine spezifische und hintergrundredu-zierte Markierung zu gewährleisten, werden helle und photostabile fluoreszente Tags benötigt. In dieser Arbeit wurde das SNAP-tag System benutzt, das den Einsatz unter-schiedlicher Farbstoffe erlaubt. Ein Vorteil dieses Systems ist die Verwendung von fluoreszenzgelöschten Benzylguanin (BG)-Farbstoffen, die erst nach erfolgter Markie-rung eine starke Fluoreszenz zeigen. Für die Entwicklung der Markierungsmethode wurden zunächst in Vorexperimenten die Farbstoffe Atto 620, Atto 633, Atto 655 und Atto 680 eingehend auf ihre Fluorogenität, ihre Photostabilität und ihr Blinkverhalten hin analysiert. Die fundierte Kenntnis dieser Eigenschaften ist essentiell für die korrekte Interpretation der aus biologischen Experimenten gewonnen Ergebnissen. Ideal für das Verfahren sind Farbstoffe, die ein hohes Fluoreszenzsignal besitzen, über eine lange Beobachtungszeit stabil sind und nicht mit der Funktion des Zielmoleküls interferieren. Die Voruntersuchungen haben gezeigt, dass Atto 633 unter den getesteten Farbstoffen die besten photophysikalischen Eigenschaften für die Markierung mit dem SNAP-tag System besitzt und zudem die beste Zellgängigkeit aufweist. Es ist damit möglich, ein-zelne Moleküle unter kontinuierlicher Laseranregung über mehrere Sekunden zu be-obachten. Darüber hinaus konnte die Markierungseffizienz in gewissen Grenzen durch die Proteinexpression, die Farbstoffkonzentration und die Inkubationszeit des Farb-stoffs kontrolliert werden. Eine geringe Markierungseffizienz ist für die Einzelmolekül-Detektion von Vorteil, da eine zu hohe Dichte an fluoreszent markierten Molekülen die Identifikation einzelner Moleküle erschwert.
Anschließend wurde ein Färbeprotokoll etabliert, welches eine spezifische, hinter-grundreduzierte Fluoreszenz-Markierung einzelner CheY-Proteine in lebenden E. coli-Zellen erlaubt, ohne dass die Funktionsfähigkeit des Proteins beeinträchtigt wird. Echt-zeit-Aufnahmen mit einer Zeitauflösung von 30 ms zeigten, dass es möglich ist, einzel-ne CheY-Moleküle bei der Bindung an einen Interaktionspartner als fluoreszenten Punkt zu beobachten. Aus den Fluoreszenzintensitätsspuren konnten die Bindungszu-stände mittels numerischer Verfahren als An- und Auszeiten extrahiert werden und deren Wahrscheinlichkeitsverteilung bestimmt werden. Aus diesen quantitativen Unter-suchungen zur Bindungskinetik von CheY konnten Hinweise auf spezifische Proteinin-teraktionen beobachtet, jedoch keine detaillierte Auskunft über Bindungszeiten gege-ben werden. Die Ursache hierfür könnten unterschiedliche Wechselwirkungen des Pro-teins, sowohl spezifischer als auch unspezifischer Art, sein. So wäre eine weitere wich-tige Entwicklung dieses Markierungssystems, die Möglichkeit zur gleichzeitigen Fär-bung von zwei oder mehreren Proteinen mit spektroskopisch unterscheidbaren fluores-zierenden Tags (z.B. dem CLIP-tag), um Kolokalisationsexperimente mit alternieren-der Laseranregung durchzuführen. Eine weitere Ursache kann man in der Natur des verwendeten Farbstoffes selbst suchen. Laser- und temperaturabhängige Untersu-chungen könnten weiteren Aufschluss über das Verhalten der Farbstoffe geben. Somit liefert das beschriebene Fluoreszenz-Markierungsverfahren einen neuen Ansatz für quantitative Untersuchungen von Proteininteraktionen in lebenden Zellen.
Malfunctions in signal transduction often cause diseases such as cancer and metabolic disorders. A thorough understanding of the relevant mechanisms of signal transduction is therefore an important requirement for the development of therapies and pharmaceuticals. In this thesis, a method was developed, which allows the observation of individual signaling proteins and their interactions in living cells. Therefore this method has advantages compared to molecular detection methods which are based on ensemble averages. As a model system for signal transduction, the bacterial chemotaxis with its regulator protein CheY was selected. The experimental studies were carried out with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), which requires a fluorescent labeling of the examined molecules. To ensure a specific and background reduced labeling, bright and photostable fluorescent ,tags are needed. In this work, the SNAP-tag system was used, which allows the use of different dyes. An advantage of this system is the possibility of using fluorescence-quenched benzyl guanine (BG)-dyes, which show a strong fluorescence only after binding to SNAP-tag. For development of the labeling method, the dyes Atto 620, Atto 633, Atto 655 and Atto 680 were analyzed in preliminary experiments regarding their fluorescence, photostability and blinking behavior. The thorough knowledge of these properties is essential for the correct interpretation of the experimental results. Dyes which are ideal for the method have a high fluorescent signal over a long observation time, and they are stable and do not interfere with the function of the target molecule. The preliminary investigations have shown that among the dyes tested, Atto 633 had the best photophysical properties for labeling with the SNAP-tag system and also the best cell permeability. This allows, under continuous laser excitation, to observe individual molecules for several seconds. In addition, the labeling efficiency was controlled by the protein expression, the dye concentration, and the incubation time of the dye. For single-molecule detection, a low labeling efficiency is of advantage since too high density of fluorescently labeled molecules makes the identification of individual molecules difficult.
Subsequently, a labeling protocol was established which allows a specific, background- reduced fluorescence labeling of individual CheY proteins in living E. coli cells, without impairment of the proteins functionality. Real-time detection with a time resolution of 30 milliseconds showed that it is possible to observe individual CheY molecules as a fluorescent point during the state of binding to an interaction partner. By means of numerical methods, the state of binding can be extracted from the fluorescence intensity traces as on/ off and their probability distribution can be determined. These quantitative studies gave indications on specific protein interactions, but no detailed information on binding times could be found. Different interactions of the protein, both specific and non-specific nature, could be the reason. Therefore, another important development of this labeling system would be the opportunity of simultaneous staining of two or more proteins with spectroscopically distinguishable fluorescent tags (e.g. CLIP-tag) to perform colocalization with alternating laser excitation. Another cause might be found in the nature of the dye itself. Laser- and temperature-dependent studies could provide further information concerning the behavior of the dyes. Thus, the described fluorescence labeling method provides a new approach for quantitative studies of protein interactions in living cells.
1477919547
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1275/
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2016/1275/pdf/Diss_Tanja_Ehrhard.pdf
Ehrhard, Tanja Margret
Universität Hohenheim, Fakultät Naturwissenschaften. Institut für Biologische Chemie und Ernährungswissenschaft
1711619765533