2024-03-28T14:25:15Z
http://opus.uni-hohenheim.de/oai2/oai2.php
oai:opus.uni-hohenheim.de:30
2003-09-01T18:01:24Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Role of reactive oxygen species in anti-cancer treatment: Investigations in 2-methoxyestradiol chemotherapy and 5-aminolevulinic acid based photodynamic therapy combined with hyperthermia
Die Rolle reaktiver Sauerstoffspezies in der Krebstherapie: Untersuchungen der Chemotherapie mit 2-Methoxyestradiol und der 5-Aminolävulinsäure basierten Photodynamischen Therapie in Kombination mit Hyperthermie
Christine
Lambert
570
Apoptosis , Photodynamische Therapie , Chemotherapie , Hyperthermie , Reaktive Sauerstoffspezies
2-Methoxyestradiol , Aminolävulinsäure apoptosis , aminolevulinic acid , 2-methoxyestradiol , photodynamic therapy , hyperthermia
The thesis deals with two different ROS-generating anti-cancer treatments: chemotherapy with the endogenous estrogen metabolite 2-methoxyestradiol and 5-aminolevulinic acid based photodynamic therapy. Both treatments were investigated with the rat DS-sarcoma model, which can be used in vitro and in vivo.
It the first part, it could be shown that 2-methoxyestradiol induces apoptosis in DS-sarcoma cells. Translocation of the pro-apoptotic protein Bax to the mitochondria was identified as initial apoptotic event, followed by a decrease in mitochondrial transmembrane potential and the release of AIF out of the mitochondria. In addition, upregulation of FasL and TNFalpha by 2-ME, two death receptor ligands, was observed. Although, 2-ME administration resulted in activation of caspases, pan caspase inhibitor Z-VAD-FMK could not block 2-ME induced apoptotic cell death pointing to a caspase-independent mechanism. Furthermore, an increase in formation of reactive oxygen species was observed after 2-ME treatment. However, supplementation with different antioxidants could not decrease the toxic effect of 2-ME. This finding may indicate, that reactive oxygen species are not involved in apoptosis induction, rather they are a consequence of mitochondrial damage.
In vitro and in vivo combination of 2-ME with another ROS-generating treatment resulted in a synergistic anti-tumour effect.
In the second part of the thesis anti-tumour effects of 5-aminolevulinic acid based photodynamic therapy combined with simultaneous hyperthermia was investigated. Analysis of apoptosis associated nuclear changes clearly demonstrated the high efficiency of this treatment regime. Formation of reactive compounds (e.g. ROS, nitrogen monoxide, peroxynitrite) which is mainly responsible for toxicity of PDT, could be assessed in the shape of massive protein nitrosylation in tumours treated with PDT alone or the combined treatment. Detection of decreased amounts of heat shock proteins (HSP70 and HO-1) which protect tumour cells against damaging influences, lowered glutathione levels and reduced MMP-activity indicate an increase in degradation of proteins. This phenomenon may be caused by excessive generation of ROS.
Taken together, the presented studies could demonstrate the high benefit of combining 2-ME resp. ALA-PDT with hyperthermia (or other ROS-generating therapies), which make them interesting candidates for future clinical applications.
Die Dissertation befasst sich mit zwei unterschiedliche ROS-generierenden Therapien zur Krebsbekämpfung: zum einen mit der Chemotherapie des endogenen Estrogenmetaboliten 2-Methoxyestradiol, sowie der Photodynamischen Therapie, die auf der Gabe von 5-Aminolaevulinsäure basiert. Beide Behandlungsformen wurden mit Hilfe des DS-Sarkom Modells der Ratte untersucht, das sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt werden kann.
Im ersten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, daß 2-ME Apoptose in DS-Sarkom Zellen induziert. Als initiales apoptotisches Ereignis wurde die Translokation des pro-apoptotischen Proteins Bax an das Mitochondrium nachgewiesen, gefolgt von einer Erniedrigung des mitochondrialen Transmembranpotentials und der Freisetzung von AIF aus dem Mitochondrium. Des weiteren wurde eine erhöhte Expression von FasL und TNFalpha, zwei ?death receptor? Liganden, nach 2-ME Gabe beobachtet. Obwohl nach 2-ME-Verabreichung eine Aktivierung von Caspasen gemessen wurde, konnte die Gabe des Pan-Caspase-Inhibitors Z-VAD-FMK den apoptotischen Zelltod nicht verhindern, was auf einen Caspase-unabhängigen Mechanismus schließen lässt. Außerdem wurde eine erhöhte Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies nach 2-ME Administration nachgewiesen, durch die Stimulierung mit verschiedenen Antioxidantien konnte jedoch die toxische Wirkung von 2-ME nicht gemindert werden. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, daß reaktive Sauerstoffspezies nicht an der Apoptoseinduktion beteiligt sind, sondern als Folge der mitochondrialen Schädigung auftreten.
Die Kombination von 2-ME mit einer weiteren ROS-erzeugenden Therapie zeigte sowohl in vitro also auch in vivo eine synergistische Steigerung der antitumoralen Wirkung.
Im zweiten Teil wurde die Tumor-inhibierende Wirkung einer auf 5-Aminolaevulinsäure basierten Photodynamischen Therapie, welche mit Hyperthermie kombiniert wurde, untersucht. Dabei konnte durch Bestimmung von Apoptose-assoziierten Veränderungen des Zellkernes der hohe Wirkungsgrad dieser Behandlungsform gezeigt werden. Die Bildung von reaktiven Verbindungen (z.B. ROS, Stickstoffmonoxid, Peroxynitrit), die hauptsächlich für die PDT vermittelte Toxizität verantwortlich sind, konnten in Form von nitrosylierten Proteinen in Tumoren bestimmt werden, die mit PDT oder der Kombinationstherapie behandelt wurden. Der Nachweis eines verringerten Gehaltes an Hitzeschockproteinen (HSP70 und HO-1), die das Tumorgewebe vor schädigenden Einflüsssen schützen, sowie ein erniedrigter Glutathionspiegels und eine reduzierte MMP-Aktivität, deuten auf eine gesteigerte Inaktivierung und Degradation von Proteinen hin. Diese wird vermutlich durch die exzessive ROS-Bildung verursacht.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß beide Kombinationstherapien (2-ME + Hyperthermie und ALA-PDT + Hyperthermie) effektiv das Tumorwachstum gehemmt haben, was sie zu interessanten Kandidaten für eine zukünftige klinische Anwendung macht.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Jürgen
Frank
Dr. rer. nat.
2003-01-30
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-301
application/pdf
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2003/30/
oai:opus.uni-hohenheim.de:100
2008-04-21T08:53:52Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Ecological studies of the Lactobacillus biota in the human digestive tract and adaptation of intestinal lactobacilli to the sourdough ecosystem
Ökologische Studie der Lactobacillus Biota im menschlichen Verdauungstrakt und Anpassung von intestinalen Laktobazillen an das Ökosystem Sauerteig
Fabio
Dal Bello
570
Lactobacillus reuteri , Lactobacillus , Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese , Verdauungskanal , Sauerteig , Speichel , Kot
IVET Lactobacillus , gastrointestinal tract , DGGE , IVET , sourdough
Laktobazillen haben unter den Bakterien, die den menschlichen Darm bewohnen, eine ansehnliche Beachtung aufgrund ihres positiven Einflusses auf das menschliche Wohlbefinden erlangt. Die Kultivierung dieser Bakterien gilt als zuverlässig, und so wurden zahlreiche Studien unter Anwendung von Kultivierungstechniken mit selektiven Medien durchgeführt, um die Laktobazillen in intestinalen Ökosystemen zu untersuchen (Tannock, 1995; Reuter, 2001). Vor kurzem führte die Anwendung der PCR-DGGE in Kombination mit Milchsäurebakterien (MSB)-spezifischen Primern zum Nachweis von Spezies, die nicht zu den klassischen intestinalen MSB gehören, sondern vielmehr Lebensmittel-assoziiert sind, z.B. Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei, Leuconostoc mesenteroides and Pediococcus pentosaceus (Walter et al., 2001; Heilig et al., 2002). Interessanterweise konnten diese Spezies nicht durch Kultivierung auf Rogosa SL Agar erhalten werden (Walter et al., 2001). Das Kapitel III beschreibt die Anwendung unterschiedlicher Kultivierungsmedien und neuer Inkubationsbedingungen, um diese Schwierigkeiten zu überwinden. Menschliche Stuhlproben wurden auf selektive und nicht-selektive Agarplatten ausplattiert, und die Platten wurden unter den klassischen Bedingungen (37°C, anaerob) für intestinalen MSB sowie unter alternativen Bedingungen (30°C, 2% O2) inkubiert. Die Analyse von bakterieller Zellmasse, die von Agarplatten abgeschwemmt wurde, mittels PCR-DGGE brachte hervor, dass die Zusammensetzung der MSB-Spezies stärker von den angewandten Inkubationsbedingungen als von den Medien beeinflusst wurde. Es konnte beobachtet werden, dass Lebensmittel-assoziierte MSB wie L. sakei und Lc. mesenteroides, die bisher nicht als intestinale Bewohner beschrieben worden waren, leichter durch Einsatz der alternativen Inkubationsbedingungen kultiviert werden können. Eine Identifizierung zufällig ausgewählter Kolonien, die unter den alternativen Bedingungen auf Rogosa SL Agar gewachsen waren, zeigte, dass L. sakei einer der dominierenden Lebensmittel-assoziierten MSB in menschlichen Fäzesproben ist und dort in Keimzahlen von bis zu 106 KbE pro Gramm vorkommen kann. Ein Vergleich der kulturtechnischen Ergebnisse mit denen der PCR-DGGE-Analyse von Bakterienmassen auf Agarplatten zeigte außerdem, dass die Untersuchung der Bakterienmassen eine schnelle und zuverlässige Methode darstellt, um einen Einblick in die Spezieszusammensetzung der kultivierbaren MSB in Fäzes zu erhalten.
Die Untersuchungen der intestinalen Laktobazillenpopulation in menschlichen Stuhlproben über einen längeren Zeitraum zeigte eine hohe Variabilität in der Komplexität und Stabilität der Spezieszusammensetzung (Vanhoutte et al., 2004; Walter et al., 2001). Ökologische Studien brachten hervor, dass die meisten Lactobacillus-Spezies im menschlichen Gastrointestinaltrakt (GIT) wahrscheinlich transient (allochthon) sind und entweder von Lebensmitteln oder aus der Mundhöhle stammen (Biblioni et al., 2004). Um zu untersuchen, inwieweit die oralen Laktobazillen einen Teil der fäkalen Laktobazillen ausmachen, wurde die Lactobacillus-Biota sowohl im Speichel als auch in Stuhlproben von drei Probanden untersucht und an zwei Zeitpunkten mit dreimonatigem Abstand verglichen (Kapitel IV). Die Zusammensetzung der Lactobacillus-Spezies im menschlichen Speichel und Fäzes war Individuum-spezifisch und fluktuierte in einem gewisse Maße, dennoch konnten die Spezies Lactobacillus gasseri, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus und Lactobacillus vaginalis an beiden Zeitpunkten sowohl im Speichel als auch Fäzes der Probanden nachgewiesen werden. Durch RAPD-PCR-Analyse konnte gezeigt werden, dass mehrere Stämme dieser Spezies im Speichel und in Fäzes desselben Probanden vorhanden waren. Stämme von L. gasseri und L. vaginalis mit identischen RAPD-Mustern konnten aus beiden Speichelproben isoliert werden, was darauf hinweist, dass diese Spezies in der Mundhöhle autochthon sind. Die Ergebnisse dieses Kapitels gemeinsam mit kürzlich publizierten Daten stellen ein starkes Indiz dafür dar, dass einige Laktobazillen, die aus Stuhlproben isoliert werden können, aus der Mundhöhle stammen und somit im Intestinum allochthon sind.
Laktobazillen sind in unterschiedlichen Ökosystemen gefunden worden und aufgrund ihrer kommerziellen Verwendung in der Lebensmittelindustrie Gegenstand umfassender Forschung gewesen (Hammes und Hertel, 2003). Einige Lactobacillus-Spezies lassen sich häufig sowohl in fermentierten Lebensmitteln als auch im menschlichen GIT nachweisen, jedoch ist der genetische Hintergrund für diese ökologische Vielseitigkeit noch weitgehend unbekannt. Lactobacillus reuteri ist ein dominantes Mitglied in der Mikrobiota von Typ II Sauerteigfermentationen (Meroth et al., 2003) und gilt als einer der echten autochthonen Lactobacillus-Spezies bei Menschen (Reuter, 2001). In Kapitel V und VI wurde die von Walter et al. (2001) entwickelte "in vivo expression technology (IVET)" angewandt, um bei dem Sauerteigisolat L. reuteri LTH5531 Gene (sogenannte in vivo induzierte (ivi)-Gene) zu identifizieren, die während des Wachstums in einer Typ II Sauerteigfermentation (Kapitel V) bzw. während der Passage durch den GIT einer Maus (Kapitel VI) eine erhöhte Expression zeigen. Während der Sauerteigfermentation wurden 38 induzierte und stark exprimierte Genfusionen gefunden (Kapitel V), die auf der Basis der verfügbaren Sequenzen eine Identifizierung von 29 Genen erlaubten. Vier Gene kodierten für Stress-verwandte Funktionen (z.B. Säure- und allgemeine Stressantwort) und spiegeln somit die harschen Bedingungen in der Sauerteigfermentation wider. Weitere 8 Gene kodierten für Proteine, die in Transport und Synthese von Aminosäuren und Nukleotiden involviert sind, was eine limitierte Verfügbarkeit beider Komponenten während der Sauerteigfermentation anzeigte. Die restlichen Gene waren entweder Teil von Stoffwechselwegen, die in keiner Korrelation zum Ökosystem standen, oder kodierten für hypothetische Proteine. Die Identifizierung einer putativen Proteinase und einer Komponente des Argininedeiminase-Stoffwechsels ist von technologischer Bedeutung, da beide dahinter stehenden Systeme potenziell an der Bildung von Aromavorläufern beteiligt sein können.
Bemerkenswerterweise wurden bei Anwendung der IVET mit der Genombibliothek, die bereits erfolgreich bei der Sauerteigstudie eingesetzt wurde (Kapitel V), keine ivi-Promotoren während der Passage von L. reuteri LTH5531 durch den GIT einer Maus identifiziert (Kapitel VI). Mit Hilfe der IVET werden durch die Expression eines "essentiellen Wachstumsfaktors" (in unserem System die Erythromycinresistenz vermittelt durch ErmGT) aktive Promotoren selektioniert, da diese Wachstum und/oder Kolonisierung des Organismus im Ökosystem erlauben (Rainey, 1999; Walter et al., 2001). Deshalb muss die Expression eines ivi-Promotors im Ökosystem permanent erfolgen und hoch genug sein, um ein vergleichbares Wachstum von ivi-Klonen und Klonen mit konstitutiven Promoter zu erhalten, insbesondere im GIT, wo langsam wachsende Bakterien sonst ausgewaschen werden. Die Ergebnisse aus Kapitel V und VI deuten darauf hin, dass L. reuteri LTH5531 keine stark exprimierten und "GIT induzierbaren" Gene besitzt, obwohl der Stamm 38 im Sauerteig spezifisch induzierbare Gene besitzt. Ivi-Gene sind wahrscheinlich eher für die Wettbewerbsfähigkeit bzw. das ökologische Verhalten eines Organismus in einem spezifischen Ökosystem verantwortlich, als Gene, die in unterschiedlichen Ökosystemen gleich stark exprimiert werden (Rainey, 1999; Gal et al., 2003; Walter et al., 2005). Somit sind Eigenschaften, die von ivi-Genen kodiert werden, eher für die Adaption verantwortlich und das Ausmaß ihrer Expression würde durch natürliche Selektion in der Art gestaltet werden, dass die ökologische Fitness verbessert wird. Die Identifizierung von 38 Sauerteig-spezifischen ivi-Genfusionen in L. reuteri LTH5531 spiegelt die lange Adaptation von LTH5531 an das Ökosystem Sauerteig wider, ebenso wie die ivi-Gene von L. reuteri 100-23, der aus Ratten isoliert wurde, die Adaption dieses Keim an den GIT von Ratten widerspiegelt (Walter et al., 2003). In der Tat wurde der Stamm LTH5531 aus einem Sauerteig isoliert, der mit einem industriellen Starter inokuliert wurde. Dieser industrielle Starter wurde über mehrere Jahre propagiert, so dass die enthaltenen Keime genug Zeit hatten sich zu adaptieren. In Übereinstimmung damit stehen die Ergebnisse von Meroth et al. (2003), die unter Anwendung der RAPD-PCR zeigten, dass der Stamm LTH5531 bereits in einem kommerziellen Typ II Sauerteigstarter enthalten war, der 10 Jahre vor der Isolierung des Stammes Gegenstand von Untersuchungen war. Das deutet darauf hin, dass sich der Stamm LTH5531 an das Ökosystem Sauerteig seit mindestens 10 Jahren angepasst hat.
Die Ergebnisse aus Kapitel V zeigen deutlich, dass die IVET eine geeignete Methode ist, die Erkenntnisse über die Genexpression und metabolische Aktivität von Bakterien während Lebensmittelfermentationen zu erweitern. Die gesammelten Ergebnisse stellen eine wichtige molekulare Grundlage dar, auf deren Basis verbesserte Starterorganismen für die Nutzung in der Lebensmittelindustrie entwickelt werden können. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse von Kapitel VI die Notwendigkeit in ökologischen Studien hoch-adaptierte, autochthone Stämme zu verwenden, um Kenntnisse über adaptive Wechselwirkungen zu erlangen, die für den ökologischen Erfolg dieser Bakterien in ihrem natürlichen Ökosystem sowie während der Lebensmittelfermentation verantwortlich sind.
Among the bacteria inhabiting the human gut, lactobacilli have received considerable attention, due to their putative health promoting effects (Reid, 1999; Vaughan et al., 1999). Cultivation of lactobacilli is considered to be reliable and numerous studies using plating on selective media have been performed to investigate these bacteria in intestinal ecosystems (Tannock, 1995; Reuter, 2001). Recently, the application of PCR-DGGE in combination with primers specific for lactic acid bacteria (LAB) detected species which are not considered to be intestinal inhabitants but food-associated, such as Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei, Leuconostoc mesenteroides and Pediococcus pentosaceus (Walter et al., 2001; Heilig et al., 2002). Remarkably, these species could not be recovered by traditional bacteriological culture on Rogosa SL agar (Walter et al., 2001). In Chapter III, different cultivation media, as well as new incubation conditions were applied to overcome these difficulties. Human faecal samples were plated on selective and non-selective media and incubated under standard condition (37°C, anaerobiosis) for faecal LAB as well as alternative condition (30°C, 2% O2). PCR-DGGE analyses of resuspended bacterial biomass (RBB) obtained from agar plates revealed that the species composition of the recovered LAB was affected stronger by the incubation condition than by the used medium. It was observed that food-associated LAB such as L. sakei and Lc. mesenteroides, hitherto not described as intestinal inhabitants, are more easily selected when the alternative incubation condition is used. Identification of randomly picked colonies grown under the alternative condition on Rogosa SL agar showed that L. sakei is one of the predominant food-associated LAB species in faecal samples, reaching counts of up to 106 CFU per gram faeces. Comparison of the results of bacteriological culture with those obtained by PCR-DGGE analysis of the RBB showed that investigation of RBB is a fast and reliable method to gain insight into the species composition of culturable LAB in faeces.
Examination of the faecal Lactobacillus populations over longer periods has revealed marked variation in the complexity and stability of these populations among human subjects (Vanhoutte et al., 2004, Walter et al., 2001). Ecological studies indicate that most Lactobacillus species found in the human gastrointestinal tract (GIT) are likely to be transient (allochthonous), originating from either the oral cavity or food (reviewed in Bibiloni et al., 2004). In order to investigate if oral lactobacilli constitute a part of the faecal Lactobacillus biota, the Lactobacillus biota of saliva and faeces of three human subjects were investigated and compared at two time-points in a three months interval (Chapter IV). The species composition of the Lactobacillus biota of human saliva and faeces was found to be subject-specific and fluctuated to some degree, but the species Lactobacillus gasseri, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus vaginalis were detected at both time-points in saliva and faecal samples of individual subjects. RAPD-PCR analysis indicated that several strains of these species were present both in the oral cavity and in the faecal samples of the same subject. Oral isolates of the species L. gasseri and L. vaginalis showing identical RAPD types were found to persist over time, suggesting that these species are autochthonous to the oral cavity. The results of Chapter IV, together with recently published data (reviewed in Bibiloni et al., 2004), give strong evidence that some lactobacilli found in human faeces are allochthonous to the intestine and originate from the oral cavity.
Lactobacilli have been detected in diverse environments and have been the subject of considerable research due to their commercial use in the food industry (reviewed in Hammes and Hertel, 2003). Several Lactobacillus species are commonly detected in both fermented food and the human GIT, but the genetic background for this ecological versatility is poorly understood. Lactobacillus reuteri is a dominant member of the microbiota of type II sourdough fermentations (Meroth et al., 2003) and is considered one of the truly autochthonous Lactobacillus species in humans (Reuter, 2001). The in vivo expression technology (IVET) developed by Walter et al. (2003) was used to identify genes (so-called ivi genes) of the sourdough isolate L. reuteri LTH5531 that show elevated levels of expression during growth of this organism in a type II sourdough fermentation (Chapter V) and during passage through the GIT of mice (Chapter VI). Thirty-eight induced fusions were found to be highly expressed during the sourdough fermentation (Chapter V), and 29 genes could be identified on the basis of the available sequence information. Four genes encoded stress-related functions (e.g. acid and general stress response) reflecting the harsh conditions prevailing during sourdough fermentation. Further eight genes were involved in acquisition and synthesis of amino acids and nucleotides, indicating their limited availability in sourdough. The remaining genes were either part of functionally unrelated pathways or encoded hypothetical proteins. The identification of a putative proteinase and a component of the arginine deiminase pathway are of technological interest, as they are potentially involved in the formation of aroma precursors.
Remarkably, IVET with the genomic library that was successfully used in the sourdough study (Chapter V) did not detect ivi promoters when LTH5531 inhabited the GIT of mice (Chapter VI). With IVET, active promoters are selected by expression of an "essential growth factor" (in our system the erythromycin resistance mediated by ErmGT) that allows the organism to colonize and/ or grow in the ecosystem (Rainey, 1999, Walter et al., 2003). Expression of ivi promoters in particular ecosystems must therefore be permanent and strong in order to allow comparable growth rates of ivi clones and clones bearing constitutive promoters, especially in the GIT, where inactive bacteria are washed out. The findings of Chapter V and VI indicate that L. reuteri LTH5531 does not possess strongly expressed "GIT inducible" genes, while possessing 38 ones specifically induced in sourdough. Ivi genes are more likely to contribute to the ecological performance of an organism in a specific environment than genes expressed equally in a broad range of habitats (Rainey, 1999, Gal et al, 2003, Walter et al., 2005). Therefore, traits encoded by ivi genes are likely to be adaptive and the extent of their expression would be shaped by natural selection to improve ecological fitness. The presence of thirty-eight "sourdough specific" ivi fusions in L. reuteri LTH5531 probably reflects the long term adaptation of LTH5531 to the sourdough environment, just as ivi genes detected in strain 100-23 reflect adaptation of this GIT isolate to the rodent GIT (Walter et al., 2003). Indeed, LTH5531 was isolated from an experimental sourdough that had been inoculated with an industrial starter. This industrial starter has been propagated over several years, giving the organisms present sufficient time to adapt. In accordance with this, by using RAPD-PCR, Meroth et al. (2003) showed that strain LTH5531 was present in a commercial type II sourdough starter collected 10 years prior isolation of LTH5531, thus indicating that this strain has adapted to the sourdough environment for at least 10 years.
The results of Chapter V clearly demonstrated that knowledge of gene expression and metabolic activities of bacteria during food fermentations can be obtained by applying IVET. The results collected provide an important molecular basis on which improved starter strains can be developed for industrial exploitation. Moreover, the results of Chapter VI show the importance of working with highly adapted, autochthonous strains in studies of microbial ecology in order to reveal the adaptive interactions responsible for the ecological success of these bacteria in their natural environment or during food fermentations.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Christian
Hertel
Priv. Doz. Dr.
2005-07-01
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-1007
application/pdf
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2005/100/
oai:opus.uni-hohenheim.de:119
2005-12-01T12:27:46Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Development of a genetically defined diploid yeast strain for the application in spirit production
Konstruktion eines genetisch definierten diploiden Laborstammes und dessen Eignung bei der Herstellung von Obstbraenden
Beatus
Schehl
570
Saccharomyces cerevisiae , Beerenobst , Steinobst , Degustation , Carcinogen , Urethan , Blasendestillation , Alkohol , Gärung , Metabolit , Molekular
Hefe, Laborstamm,Fruchtmaischen, Obstbrand, Ethylcarbamat, Sensorik Yeast, Saccharomyces cerevisiae, fruit mashes, fermentation, sensory tests, urethane
Hefen sind in der Natur mit vielen Arten weit verbreitet. Seit Urzeiten werden Hefen zur Herstellung von Brot, Bier, Essig, Wein und anderer Lebensmittel eingesetzt. Der Gärorganismus Saccharomyces cerevisiae spielt besonders bei der Herstellung alkoholischer Getränke, insbesondere der Obstbrennerei, eine entscheidende Rolle. Ohne geeignete Konservierungsmaßnahmen beginnen Fruchtmaischen auch ohne einen Zusatz von heute erhältlichen Reinzuchthefen zu gären. Dieser als Spontangärung bezeichnete Vorgang führt durch sogenannte ?wilde Hefen? zur Bildung erwünschter wie unerwünschter Gärungsnebenprodukte (wie Glycerin, organische Säuren und höhere Alkohole). Diese Nebenprodukte können in den Branntweinerzeugnissen Geruchs- und Geschmacksfehler erzeugen.
Im Laufe der Jahrzehnte ist durch gezielte Selektion und Kreuzung bestimmter Stämme eine Spezialisierung in Form der heute erhältlichen Hefe-Reinzuchtstämme erfolgt. Ein gezielter und optimaler Hefeeinsatz im Bereich der Obstbrennerei kann im Allgemeinen nur nach einem überlegten Zusammenspiel von anbaulichen, verarbeitungs- und gärungstechnischen Voraussetzungen im Betrieb erfolgen. Dennoch sind die auf dem Markt erhältlichen Reinzuchthefen auf Grund hoher Mutationsraten stark heterogen, so dass die ?angezüchteten? Eigenschaften weitestgehend verloren gehen können. Eine gezielte genetische Modifikation zur Verbesserung bestimmter Gäreigenschaften der Hefe wird dadurch unmöglich gemacht. Ziel dieser Arbeit war es, einen genetisch definierten Hefestamm zu konstruieren und diesen speziell im Bereich der Obstbrennerei auf seine Eignung im Vergleich zu handelsüblichen Präparaten hinschtlich der Fermentationsleistung und der sensorischen Eigenschaften zu etablieren. Daneben wurde weiterfuehrend das Ethylcarbamat-Bildungspotential durch gezielte genetische Modifikation reduziert.
Yeast strains of the species Saccharomyces cerevisiae currently in use for the production of consumable alcohols such as beer, wine and spirits are genetically largely undefined. This prevents the use of standard genetic manipulations, such as crossings and tetrad analysis, for strain improvement. Furthermore, it complicates the application of the majority of modern methods developed in yeast molecular biology. In this work two haploid laboratory strains with suitable auxotrophic markers were used for the construction of a genetically well defined, prototrophic diploid production strain. This strain was tested for its fermentative and sensory performances in comparison to commercially available yeasts. Different fruit mashes were fermented, subjected to distillation and analysed for fermentation parameters including growth, sugar utilization, ethanol production and generation of volatile compounds, higher alcohols, uretahne and glycerol. All spirits produced were tested for their sensory performances and the data obtained statistically consolidated. Our results clearly demonstrate that this laboratory strain does not display any disadvantage compared with commercial yeasts in spirit production for any of the parameters tested, yet it offers the potential to apply both classical breeding and modern molecular genetic techniques adjusting yeast physiology to special production schemes.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Juergen
Heinisch
Prof. Dr.
2005-10-21
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-1197
application/pdf
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2005/119/
oai:opus.uni-hohenheim.de:125
2008-05-29T08:08:59Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Einfluss kurzkettiger Fettsäuren und mikrobieller Fermentationsprodukte neuartiger Oligosaccharide auf Cytotoxizität, Proliferation und Apoptose von humanen Coloncarcinom-Zelllinien
Effects of short chain fatty acids and microbial fermentation products of novel oligosaccharides on cytotoxicity, proliferation, and apoptosis of human colon carcinoma cell lines
Silvia
Roser
570
Oligosaccharide , Fermentation
Kurzkettige Fettsäuren, Coloncarcinogenese oligosaccharides, fermentation, short chain fatty acids, colon carcinogenesis
Dickdarmkrebs ist in Deutschland bei Männern und Frauen die zweithäufigste Krebserkrankung. Die Rolle von Ballaststoffen bei der Prävention von
Dickdarmkrebs bleibt umstritten: Vielversprechenden in vitro- und Tierexperimenten stehen widersprüchliche epidemiologische Studien gegenüber. Funktionelle Kohlenhydrate als Bestandteile präbiotischer Lebensmittel sollen die Colon-Mikroflora zu Gunsten von Bakterienstämmen verändern, die kurzkettige Fettsäuren (SCFA) bilden und deren Konzentrationen im Colon, auch im distalen Teil, wo die meisten Coloncarcinome entstehen, erhöhen. SCFA, vor allem Butyrat, gelten als präventiv wirksame Substanzen gegen Dickdarmkrebs. Für die vorliegende Arbeit wurden drei verschiedene, von der Firma Südzucker neu entwickelte, funktionelle Oligosaccharide (OS, hergestellt aus Isomaltulose und resistenter Stärke) mit Humanfaeces gesunder Probanden in vitro fermentiert. Die daraus gewonnenen Fermentationsüberstände (FÜ) wurden im Zellkultursystem an Coloncarcinom-Zelllinien unterschiedlicher Differenzierungsgrade (HT29, HT29 Clon 19A, T84) getestet. Untersucht wurden cytotoxische Effekte, proliferationshemmende Wir-kung, Apoptoseinduktion, Einfluss auf den Zellzyklus und elektrophysiologische Para-meter. Zur Anwendung kamen spektralphotometrische und durchflusscytometrische Methoden sowie Messungen in vertikalen Diffusionskammern (Ussing-Kammern). Bei allen Versuchen wurden parallel SCFA-Gemische, deren SCFA-Konzentrationen analog den FÜ waren, untersucht, außerdem ein FÜ ?Kontrolle?, der ohne OS-Fermentation hergestellt wurde. In mehreren voneinander unabhängigen Fermentationen konnten reproduzierbare Ergebnisse hinsichtlich der SCFA-Gehalte der FÜ erzielt werden. Das Verhältnis der drei Haupt-Fettsäuren Acetat, Propionat und Butyrat in den FÜ nach OS-Fermentation entsprach weitgehend den in vivo-Verhältnissen. Die untersuchten FÜ und SCFA-Gemische wirkten in der Konzentration von 50 % bei allen Zelllinien cytotoxisch. Ebenso war eine dosisabhängige Proliferationshemmung und in der Konzentration von 50 % die Induktion von Apoptose zu verzeichnen. Durch die parallele Untersuchung analoger SCFA-Gemische in PBS konnte gezeigt werden, dass cytotoxische und proliferationshemmende Effekte der FÜ im Wesentlichen auf ihren SCFA-Gehalt zurückzuführen sind. Für die Apptoseinduktion konnte dies nicht bestätigt werden: Die SCFA-Gemische induzierten überwiegend mehr Apoptose als die entsprechenden FÜ. Ebenso waren die Wirkungen von FÜ und SCFA-Gemischen auf den Zellzyklus unterschiedlich: Die SCFA-Gemische konnten die DNA-Synthese-Phase zum Teil deutlich stärker hemmen als die FÜ; die FÜ führten hauptsächlich zu einem G2-Arrest. Bei den elektrophysiologischen Untersuchungen in Ussing-Kammern zeigten weder FÜ noch SCFA-Gemische Effekte auf transepithelialen Widerstand oder Kurzschlusstrom. Die Fermentationsmuster der verwendeten FÜ und die SCFA-Konzentrationen der ent-sprechenden Gemische unterschieden sich nicht stark genug voneinander, um in den verwendeten Testsystemen signifikant
unterschiedliche Ergebnisse zu erzielen. Auch die verwendeten Zelllinien zeigten ein inkonsistentes Verhalten nach Inkubation mit FÜ bzw. SCFA-Gemischen, so dass keine Beziehung zwischen Differenzierungsgrad und Wirkung der Testsubstanzen hergestellt werden konnte. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass aus der in vitro-Fermentation von OS mit Humanfae-ces reproduzierbare SCFA-Muster resultieren, die den in vivo-Verhältnissen gleichen. Gleichzeitig wurde ein Methodenspektrum für das Screening von FÜ bzw. SCFA-Gemischen bei unterschiedlich differenzierten Coloncarcinom-Zelllinien entwickelt, das die Zellen in allen Wachstumsphasen (exponentiell, subkonfluent, konfluent, ausdifferenziertes Monolayer) erfasst. Die Wirkungen der FÜ waren allerdings nur zum Teil auf die darin enthaltenen SCFA zurückzuführen. Welche anderen FÜ-Inhaltsstoffe, vor allem hinsichtlich ihrer apoptosehemmenden und Zellzyklus-beeinflussenden Wirkungen, eine Rolle spielen, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden. Ebenso erlaubt die vorliegende Arbeit keine Rückschlüsse darauf, welche der für die Fermentati-on verwendeten OS eine besonders positive Wirkung auf Faktoren haben, die die Coloncarcinogenese hemmen können (z.B. Induktion von Apoptose). Für zukünftige Studien sollten FÜ mit größeren Unterschieden in ihrer SCFA-Zusammensetzung verwen-det werden. Außerdem sollten dieselben OS, die für die in vitro-Fermentationen verwendet werden, in Tierstudien oder in humanen Interventionsstudien hinsichtlich ihrer Fermentierbarkeit untersucht werden.
Colon cancer is the second most common cancer in Germany. The role of dietary fibre in the prevention of colon cancer is still controversial: Promising results from in vitro and animal studies are contradictory to inconsistent results from epidemiological stu-dies. Functional carbohydrates as constituents of prebiotic food can modify the colonic microflora for the benefit of short chain fatty acid (SCFA)-producing microbial strains. The SCFA-concentrations should also be increased in the distal part of the colon where most colon carcinomas are developing. SCFA are considered to be preventive against colon cancer. For this study, three different new functional oligosaccharides (OS, made of Isomaltulose and resistant starch) were produced from the Südzucker company and fermented in vitro with human feces of healthy test subjects. The resulting fermentation supernatants (FS) were tested in a cell culture system, using colon carcinoma cell lines of various degrees of differentiation (HT29, HT29 Clone 19A, T84). Cytotoxicity, proliferation, the induction of apoptosis, influences on the cell cycle and electrophysiological parameters were measured. Spectral photometric and flow cytometric methods were performed, as well as measurements in vertical diffusion chambers (Ussing chambers). The parallel testing of SCFA-mixtures with the same SCFA-concentrations as in the FS was included, as well as the testing of a FS ?Control? which was produced without OS-fermentation. Several independent fermentations revealed reproducible results regarding the SCFA-concentrations of the FS. After OS-fermentation, the ratio of the three major SCFA in the FS, acetate, propionate, and butyrate, was similar to that observed in vivo. The FS and SCFA-mixtures tested had a cytotoxic effect on all cell lines at the con-centration of 50 %. A dose dependent decrease in cell proliferation could be found, as well as the induction of apoptosis at a concentration of 50 %. Parallel testing of the analogous SCFA-mixtures showed that cytotoxic and proliferation inhibiting effects of the FS could be primarily attributed to their SCFA-content. This could not be confirmed for apoptosis induction: the SCFA-mixtures were mostly able to induce a higher apoptosis rate than the FS. Similarly, the effects of FS and SCFA-mixtures on the cell cycle were different: The SCFA-mixtures showed more potent inhibition of DNA-synthesis than the analogous FS, which generally led to an arrest in the G2-phase of the cell cycle. Neither FS nor SCFA-mixtures had an impact on transepithelial resistance or short circuit current of differentiated cell monolayers in Ussing chambers. The difference in the fermentation patterns of the various FS and the SCFA-concentrations of the SCFA-mixtures was not great enough to achieve significantly different results in the test systems used. Also, the various differentiation grades of the cell lines showed inconsistent results after treatment with FS and their SCFA-mixtures, so that no correlation could be found between degree of differentiation and test compound action. This study shows that the in vitro fermentation of OS with human feces results in reproducible SCFA-patterns in the FS, similar to the in vivo situation. For the screening of FS and their SCFA-mixtures, respectively, a spectrum of methods was established for the incubation with colon carcinoma cell lines of various differentiation states and of all stages of growth (exponential, subconfluent, confluent, fully differentiated monolayer). Indeed, the effects measured after incubation with FS could only in part been ascribed to their SCFA content. Other FS components than SCFA that play a role, especially regarding to their apoptosis inhibiting and cell cycle influencing effects, remain to be identified. Also, this study allows no conclusions to be drawn, which of the fermented OS is more promising in it?s beneficial influence on colon cancer preventing factors, e.g. the induction of apoptosis, than the other. Future studies should investigate FS with greater differences in their SCFA-concentrations. The same OS which were used for the in vitro fermentation, should also be tested in animal studies and human intervention studies to elucidate their fermentation patterns in vivo.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Gerhard
Rechkemmer
Prof. Dr. rer. nat.
2006-01-09
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-1253
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2006/125/
oai:opus.uni-hohenheim.de:152
2008-04-24T09:17:27Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Einfluss von Karotten- und Tomatensaft-Konsum auf Coloncarcinogenese-relevante Faecesmarker beim Menschen
Influence of carrot and tomato juice consumption on faecal markers relevant to colon carcinogenesis in humans
Kerstin
Schnäbele
570
Karottensaft , Tomatensaft , Carotinoide , Lycopin , Provitamin A , Carcinogenese
Beta-Carotin , Faecesmarker , Faeceswasser, Coloncarcinogenese carotenoids , faecal water , faecal markers , colon carcinogenesis
Colorectaler Krebs stellt weltweit eine der häufigsten Tumorerkrankungen dar. Die meisten colorectalen Tumoren sind sporadisch und entwickeln sich somatisch in Epithelzellen aufgrund genetischer Veränderungen. Ernährungsfaktoren können die Tumorentwicklung maßgeblich beeinflussen. Ein hoher Obst- und Gemüseverzehr wird häufig mit einem erniedrigten colorectalen Krebsrisiko in Verbindung gebracht. Krebsprotektive Wirkungen von Obst und Gemüse werden auf darin enthaltene Substanzen mit potenziell anticarcinogenen Eigenschaften wie Ballaststoffe, Vitamine und sekundäre Pflanzenstoffe, z.B. Carotinoide, zurückgeführt. In dieser Arbeit sollte anhand einer Humaninterventionsstudie mit Karotten- und Tomatensaft-Konsum untersucht werden, ob eine carotinoidreiche Ernährung, insbesondere reich an beta Carotin und Lycopin, Coloncarcinogenese-relevante Prozesse im Lumen des Gastrointestinaltraktes modifizieren kann. Dazu sollten verschiedene Faecesmarker etabliert und eingesetzt werden. In der randomisierten Interventionsstudie im Crossover-Design konsumierten 22 gesunde, männliche Probanden bei ansonsten carotinoidarmer Ernährung täglich 330ml Karotten- oder Tomatensaft über einen Zeitraum von zwei Wochen. Beiden Saft-Interventionen gingen 14-tägige Depletionsphasen mit carotinoidarmer Ernährung voraus. Am Ende jeder Studienphase wurde von zwölf Probanden 48h-Stuhl gesammelt, aus dem verschiedene Präparationen wie unfiltriertes bzw. steril-filtriertes Faeceswasser (FW) und Faeces-Lipidextrakte für den Einsatz im Zellkultursystem gewonnen wurden. Bei Untersuchungen zur Wirkung dieser Präparationen auf Colonadenocarcinomzellen (HT-29) und zur Bestimmung der Aktivität bakterieller Enzyme in FW kamen spektralphotometrische und durchflusscytometrische Methoden zum Einsatz. HPLC-Analysen dienten zur Bestimmung der Konzentrationen verschiedener Gallensäuren in FW und der Carotinoid- sowie Malondialdehyd (MDA)-Gehalte in Faeces-Proben. Die FW-Konzentrationen der wichtigsten kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) wurden gaschromatographisch erfasst. Der Verzehr von Karotten- bzw. Tomatensaft führte zu einem deutlichen Anstieg der Faeces-Gehalte an Beta- und Alpha-Carotin bzw. Lycopin sowie der Carotinoid-Konzentrationen in unfiltriertem FW. In der sich anschließenden Depletionsphase gingen die Carotinoid-Faeces- bzw. FW-Gehalte wieder auf ihre Ausgangswerte zurück. Eine Veränderung des Faeces-MDA-Gehaltes durch die Saft-Interventionen konnte nicht beobachtet werden. FW zeigte eine deutliche dosisabhängige cytotoxische Wirkung auf HT 29 Zellen, die jedoch durch Karotten- und Tomatensaft-Konsum nicht merklich verändert wurde. Darüber hinaus konnte die proliferationshemmende Wirkung von FW, die Konzentration der erfassten Gallensäuren (GS) und das FW-GS-Profil durch Karotten- und Tomatensaft-Konsum nicht beeinflusst werden. Auch die bakterielle Beta-Glucosidase bzw. -Glucuronidase-Aktivität änderte sich nicht durch die Saft-Interventionen. Während Tomatensaft-Konsum den FW-pH nicht signifikant beeinflusste, wurde dieser durch Karottensaft-Konsum erniedrigt. Obwohl die FW-Acetat- und -Butyrat-Konzentration zur Erniedrigung des FW-pH-Wertes beitrugen, waren die SCFA vermutlich nicht für die beobachtete pH-Wert-Änderung nach Karottensaft-Konsum verantwortlich. FW-SCFA-Konzentrationen bzw. das SCFA-Verhältnis wurden nicht signifikant verändert. Weder die FW-GS- und
-SCFA-Konzentrationen noch die Aktivität der untersuchten bakteriellen Enzyme nahmen Einfluss auf die cytotoxische Wirkung von FW. Mit zunehmendem Anteil der primären Gallensäuren Chol- und Chenodesoxycholsäure nahm dessen cytotoxische Wirkung, ungeachtet der verschiedenen Studienphasen, jedoch ab. Laut multipler Regressionsanalyse wichtige Einflussfaktoren für die wachstumshemmende FW-Wirkung sind wahrscheinlich v.a. der Faeces-MDA-Gehalt und die bakterielle Beta-Glucosidase-Aktivität. Ob die aufgeführten Parameter direkten Einfluss auf die cytotoxische bzw. antiproliferative FW-Wirkung nehmen oder indirekte Marker für z.B. die Aktivität der individuellen Mikroflora darstellen, sollte nachfolgend untersucht werden. Karotten- und Tomatensaft-Konsum erhöhten deutlich die cytotoxische Wirkung von Faeces-Lipidextrakten in HT-29 Zellen, vermutlich bedingt durch Apoptoseinduktion. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass bei jungen, gesunden Probanden bei ausgewogener Energie- und Makronährstoffzufuhr eine zweiwöchige Intervention mit carotinoidreichen Säften nur geringe Änderungen in Coloncarcinogenese-relevanten luminalen Prozessen hervorruft. Fehlende Wirkungen auf die toxischen und antiproliferativen Eigenschaften von FW, Lipidperoxidation in Faeces, FW-GS- und SCFA-Konzentrationen und die Aktivität einiger bakterieller Enzyme weisen darauf hin, dass entsprechende physiologische Prozesse unter den beschriebenen Ausgangsbedingungen durch eine carotinoidreiche Ernährung nicht beeinflusst werden und andere anticarcinogene Mechanismen von größerer Bedeutung sind.
Colorectal cancer is one of the most common tumor diseases in the world. Most of the colorectal tumors are sporadic and develop somatically in epithelial cells.
Nutritional factors can markedly affect tumor development. A high intake of fruits and vegetables is often associated with a reduced risk of colorectal cancer. Protective effects of fruits and vegetables are attributed to ingredients, such as fibers, vitamins, and secondary plant products (e.g. carotenoids), which have potential anticarcinogenic properties. The aim of this study was to investigate, by means of a human intervention trial with carrot and tomato juice consumption, whether a diet rich in carotenoids, especially high in beta-carotene and lycopene, can modify processes relevant to colon carcinogenesis in the gastrointestinal lumen. Therefore, several faecal markers had to be established and used in this study. In the randomized crossover trial, 22 healthy male subjects on a low-carotenoid diet consumed 330ml of carrot or tomato juice daily for a period of two weeks. The two juice intervention periods were preceded by two-week depletion phases. At the end of each study period the stool of twelve volunteers was collected over a 48-hour period. This stool was used to produce some preparations such as non-filtered and sterile-filtered faecal water, as well as faecal lipid extracts, in order to use them in cell culture systems. Spectral photometric and flow cytometric methods were used to determine the effects of the above-mentioned preparations on colon adenocarcinoma cells (HT-29), as well as to determine the activities of the bacterial enzymes beta- glucosidase and beta-glucuronidase in faecal water. HPLC methods were used to measure the concentrations of several bile acids in faecal water, as well as to determine the concentrations of carote-noids and malondialdehyde (MDA) in faecal samples. The concentrations of the major short chain fatty acids (SCFA) were measured via gas chromatography. Consumption of carrot juice led to a marked increase of beta-carotene and alpha-carotene in faeces and in non-filtered faecal water, as did lycopene after consumption of tomato juice. In the succeeding depletion phases, the contents of those carotenoids in faeces and faecal water returned to their initial values. Changes in faecal MDA concentrations by carrot and tomato juice interventions could not be observed. Faecal water showed high, dose-dependent cytotoxic effects on HT-29 cells. Those effects were, however, not markedly changed by carrot and tomato juice consumption. Neither bile acid concentrations nor the bile acid profile in faecal water changed after carrot and tomato juice consumption. Bacterial activities of beta-glucosidase and beta-glucuronidase also did not change. While tomato juice consumption did not significantly affect the pH value of faecal water, this value was, however, decreased by carrot juice consumption. Although faecal water concentrations of acetate and butyrate contributed to the decrease in faecal water pH values, SCFA were probably not responsible for the observed pH changes after carrot juice consumption. SCFA concentrations in faecal water and SCFA proportions did not change significantly. Neither bile and SCFA concentrations, nor the activities of tested bacterial enzymes, had any influence on the cytotoxic effects of sterile-filtered faecal water. These cytotoxic effects, however, decreased with increasing proportions of the primary bile acids cholic and chenodesoxycholic acid, independent of the study phases. As determined by multiple regression analysis, the most probable leading factors for the growth inhibitory effects of faecal water are the faecal MDA content and bacterial beta-glucosidase activity. Further studies should investigate whether the parameters mentioned directly influence cytotoxic and antiproliferative effects of faecal water or if those parameters are indirect markers for the activity of individual microflora. Carrot and tomato juice consumption strongly increased the cytotoxic effects of faecal lipid extracts in HT-29 cells, likely caused by the induction of apoptosis. Which mechanisms account for these effects and the consequences of these effects in the in vivo situation should be investigated in further studies. This work shows that two-week interventions with carotenoid-rich juices lead only to minor changes in luminal processes relevant to colon carcinogenesis in young healthy volunteers on an energy- and macronutrient-balanced diet. Lacking effects on 1) the toxic and antiproliferative properties of faecal water, 2) lipid peroxidation in faeces, 3) the bile and SCFA concentrations in faecal water, and 4) bacterial enzyme activities indicate that related physiological effects can not be influenced by a diet rich in carotenoids under the just described conditions. Other anticarcinogenic mechanisms seem to be of greater importance.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Karlis
Briviba
Priv. Doz. Dr. med.
2006-05-11
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-1526
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2006/152/
oai:opus.uni-hohenheim.de:156
2006-08-30T11:46:38Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Functional characterization of the COOH-terminal kinase activity of the TBP-associated factor TAF1
Funktionelle Charakterisierung der COOH-terminalen Kinaseaktivität des TBP-assoziierten Faktors TAF1
Tobias
Maile
570
Genregulation , Transkription <Genetik> , Transkriptionsfaktor , Histone , Phosphorylierung , Histon H2 , Chromatin , Modifikation <Biochemie> , Postt
TAF1 , TAF250 , TFIID , H2B , Transkriptionsfaktor TAF1 , TAF250 , TFIID , H2B , histone code
Activation of eukaryotic transcription involves an orchestrated interplay between transcription factors and the general RNA polymerase II (Pol II) transcription machinery (GTM), which consists of Pol II and general transcription factors (GTFs). The GTF TFIID consists of the TATA-box binding protein (TBP) and several TBP-associated factors (TAFs). The binding of TFIID to promoters can nucleate transcription. TAF1 is the largest subunit of TFIID and plays a central role within the nucleating function of TFIID in transcription. TAF1 mediates the binding of TFIID to promoters and interacts with enhancer-bound transcription factors and several GTFs. Additionally, TAF1 contains four enzymatic activities that are essential for viability of eukaryotes and mediate posttranslational modification of GTFs and histones. TAF1 is a bipartite protein kinase and contains an NH2-terminal kinase domain (NTK) and a COOH-terminal kinase domain (CTK). A previous study demonstrated that the CTK phosphorylates serine-residue 33 in histone H2B (H2BS33). However, the role of TAF1-mediated phosphorylation in transcription regulation remained unknown. In this study, the functional importance of H2BS33 phosphorylation (H2BS33P) by TAF1 was investigated by using a combination of biochemical and in vivo assays.
In vitro kinase assays uncovered the two essential kinase motifs in TAF1CTK, the ATP-binding motif and the serine/threonine-specific catalytic motif, and indicate that the TAF1 CTK has intrinsic kinase-activity. Western blot analysis using an antibody to H2BS33P revealed that H2BS33 is phosphorylated in Drosophila. RNA-interference (RNAi) assays, designed to attenuate TAF1 expression (TAF1RNAi), revealed that TAF1 is a major kinase for H2BS33 in Drosophila Schneider cells. Flow-cytometry analysis of TAF1RNAi cells indicated that loss of TAF1 expression results in cell cycle arrest in G2/M-phase. Screening the transcription of cell cycle genes in TAF1RNAi cells by using reverse-transcriptase-PCR demonstrated that the transcription of the cell cycle gene string (stg) is reduced in the absence of TAF1. Chromatin immunoprecipitation assays (XChIP) indicate that H2BS33P is detectable at the transcriptionally active stg promoter but not at the silent stg promoter in TAF1RNAi cells. These results demonstrate that phosphorylation of H2BS33 is involved in stg transcription. XChIP-assays using chromatin prepared from Drosophila embryos, which express a mutant TAF1 lacking the CTK, revealed that CTK-mediated phosphorylation of H2BS33 plays an essential role in the activation of transcription of the Drosophila segmentation gene giant. In vitro kinase assays demonstrate that Bdf1 and Bdf2, the yeast homologues of the TAF1CTK, phosphorylate histones suggesting that the kinase activity of the TAF1CTK is phylogenetically conserved. The results of this work demonstrate that TAF1CTK is a major histone kinase of H2BS33 and that TAF1-mediated phosphorylation of H2BS33 plays an essential role in the transcription events during cell cycle progression and development.
Die Aktivierung eukaryotischer Transkription umfaßt eine geordnete Interaktion zwischen Transkriptionsfaktoren und der generellen RNA Polymerase II (Pol II) Transkriptionsmaschinerie (GTM), welche aus Pol II und generellen Transkriptions-Faktoren (GTFs) gebildet wird. Der GTF TFIID besteht aus dem TATA-Box-bindenden Protein (TBP) und mehreren TBP-assoziierten Faktoren (TAFs). Die Bindung von TFIID an Promotoren kann Transkription nukleieren. TAF1 ist die größte Untereinheit von TFIID und spielt eine zentrale Rolle bei der nukleierenden Funktion von TFIID in Transkription. TAF1 vermittelt die Bindung von TFIID an Promotoren und interagiert mit Enhancer-gebundenen Transkriptionsfaktoren sowie mehreren GTFs. Desweiteren enthält TAF1 vier enzymatische Aktivitäten, welche essentiell für die Entwicklung von Eukaryoten sind und posttranslationelle Modifikationen von GTFs und Histonen vermitteln. TAF1 ist eine zweiteilige Proteinkinase und enthält eine NH2-terminale Kinasedomäne (NTK) sowie eine COOH-terminale Kinasedomäne (CTK). Eine frühere Studie zeigte daß die CTK Serin 33 in Histon H2B (H2BS33) phosphorylieren kann. Welche Rolle die TAF1-vermittelte Phosphorylierung in der Transkription spielt, blieb jedoch unbeantwortet. In dieser Studie wurde die funktionelle Bedeutung der Phosphorylierung von H2BS33 (H2BS33P) durch TAF1 mittels Kombination von biochemischen Assays und Experimenten in vivo untersucht. Mit Hilfe von in vitro Kinase-Assays wurden die zwei essentiellen Kinasemotive in TAF1CTK, das ATP-bindende Motiv und das Serin/Threonin-spezifische katalytische Motiv, aufgedeckt und gezeigt, daß TAF1CTK intrinsische Kinaseaktivität besitzt. Western-Blot-Analysen mit Antikörpern gegen H2BS33P zeigen, daß H2BS33 in Drosophila phosphoryliert ist. RNA-Interferenz Experimente (RNAi), welche eine Abschwächung der Expression von TAF1 bewirkten, zeigen, daß TAF1 eine bedeutende Kinase für H2BS33 in Drosophila Schneider-Zellen darstellt. Durchflußzytometrische Analysen von TAF1RNAi-Zellen ergaben, daß die Reduzierung der Expression von TAF1 einen Zellzyklusarrest in G2/M-Phase bewirkt. Ein Screening der Transkription von Zellzyklusgenen in TAF1RNAi-Zellen zeigte, daß die Transkription des Zellzyklusgens string (stg) in der Abwesenheit von TAF1 reduziert ist. Chromatin Immunopräzipitierungsassays (XChIP) detektierten H2BS33P am transkriptionell aktiven stg promoter, jedoch nicht am transkriptionell inaktiven stg promoter in TAF1RNAi-Zellen. Diese Ergebnisse demonstrieren, daß die Phosphorylierung von H2BS33 an der Transkription von stg beteiligt ist. XChIP-Assays mit Chromatin aus Drosophila Embryos, welche eine TAF1-Mutante ohne CTK exprimieren, deckten außerdem auf, daß die CTK-vermittelte Phosphorylierung von H2BS33 eine essentielle Rolle bei der Transkriptionsaktivierung des Drosophila Segmentierungsgens giant spielt.
In vivo Kinase-Assays zeigen daß Bdf1 und Bdf2, Homologe von TAF1CTK in Hefe, Histone phosphorylieren und legen nahe, daß die Kinaseaktivität von TAF1CTK phylogenetisch konserviert ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit charakterisieren TAF1CTK als eine bedeutende Histonkinase von H2BS33 und zeigen daß die TAF1-vermittelte Phosphorylierung von H2BS33 eine bedeutende Rolle in der Transkription zellzyklus- und entwicklungsspezifischer Gene spielt.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Frank
Sauer
Prof. Dr.
2006-07-13
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-1568
application/pdf
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2006/156/
oai:opus.uni-hohenheim.de:158
2006-09-22T09:10:03Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Effekt der Überproduktion von Enzymen des Glucosestoffwechsels auf das Wachstum und die Alkoholbildung in der Hefe Saccharomyces cerevisiae
Effect of overproduction of enzymes involved in glucose metabolism on growth and alcoholic fermentation in the yeast Saccharomyes cerevisiae
Markus
Emili
570
Gärung , Glucosestoffwechsel , Molekulargenetik , Überproduktion
Hefe fermentation , glucose metabolism , molecular genetics , overproduction , yeast
Die Wein-, Bier- und Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist der Hauptproduzent in der weltweiten Alkoholproduktion. Im Rahmen der Untersuchungen zur Bioethanolproduktion sollten in der vorliegenden Arbeit die Auswirkungen der Überproduktion aller am Glucoseumsatz der Hefe Saccharomyces cerevisiae beteiligten Enzyme in vivo untersucht werden, um die Möglichkeit einer beschleunigten Ethanolproduktion zu eröffnen. Hierzu war von Vorteil, dass S. cerevisiae sowohl klassisch-genetisch als auch molekulargenetisch zu den bestuntersuchten eukaryontischen Organismen zählt. So standen zwei verschiedene Hochkopienzahl-Vektoren zur Verfügung, in die im ersten Teil der Arbeit jeweils die Hälfte der zu exprimierenden Gene eingesetzt werden konnten. Dies erfolgte in den ersten Schritten durch Restriktion und Ligation und im weiteren Verlauf durch eine Kombination der PCR-Technik zur Amplifikation der in Frage kommenden Genomfragmente mit der effizienten homologen Rekombination in vivo. So wurden sowohl das Gen für einen Hexosetransporter (HXT1), als auch alle für die Glykolyseenzyme kodierenden Gene (HXK2, PGI1, PFK1, PFK2, FBA1, TPI1, TDH1 bzw. TDH2, PGK1, GPM1, ENO2, PYK1) und die für die abschließenden Schritte der Umwandlung von Pyruvat in Ethanol kodierenden Gene (PDC1, ADH1) kloniert. Nach Isolierung aus der Hefe wurden die entsprechenden Plasmide anschließend in E. coli amplifiziert und Restriktionsanalysen unterzogen. Die Bestimmung der spezifischen Enzymaktivitäten in Extrakten aus entsprechenden Hefetransformanten ergab eine leichte Überproduktion (Faktor 1,5 bis 3,0) für alle Enzyme mit Ausnahme der Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase. Für HXT1 wurde eine deutlich erhöhte Transkriptionsrate (Faktor 14 im Vergleich zum Ausgangsstamm) als Indiz für die tatsächliche Überproduktion gewertet. In den enzymatischen Messungen zeigte sich eine deutliche Tendenz zur Senkung der Überproduktion mit zunehmender Zahl der plasmidkodierten Gene. Hieraus läßt sich eine negative Rückkopplung in Bezug auf die Regulation des Glykolyseflusses ableiten.
Untersuchungen der Wachstumsraten im zweiten Teil der Arbeit zeigten ebenfalls eine deutliche Reduktion mit Zunahme der exprimierten Gene. In Bezug auf die physiologischen Parameter führte dies letztlich zu gleichbleibenden Glucoseverbrauchs- und Ethanolbildungs-Koeffizienten relativ zur Wildtyp-Kontrolle bei vergleichbaren Ausbeutekoeffizienten. Interessanterweise führte die Aufhebung der ATP-Hemmbarkeit im Phosphofructokinase-Schritt durch die Expression eines Mutantenallels von PFK1 zu einem verbesserten Wachstum ansonsten isogener Transformanten. Dieses Ergebnis unterstützt die physiologische Bedeutung der allosterischen Regulation in diesem zentralen Glykolyseschritt. Ein Verlust glykolytischer Enzymaktivitäten in Deletionsmutanten führt bei S. cerevisiae in der Regel zur Wachstumshemmung. Daher wurde in einem weiteren Teil der Arbeit mit der Konstruktion eines Hefestammes begonnen, bei dem allein die Anzucht mit verschiedenen Zuckerquellen selektiv für den Erhalt der Überproduktionsplasmide sein sollte. Hierzu wurde ein Stamm mit einer pgi1-Deletion mit einem pyk1-Deletionsstamm gekreuzt und einer Tetradenanalyse unterzogen. Erste Versuche mit Zwischenkonstrukten deuten hier bereits auf eine deutliche Erhöhung der Plasmidstabilität nach Anzucht auf komplexen Medien hin. Aus der vorliegenden Arbeit leiten sich wertvolle Erkenntnisse über die Regulation des Glykolyseflusses in vivo ab, die die Basis für weitere Untersuchungen zur Steigerung der Ethanolproduktionsrate durch Hefe bilden
The wine-, beer- and baker's yeast Saccharomyces cerevisiae is the major source in world wide alcohol production. Regarding the research in bioethanol production, the work presented here was aimed to examine the effect of the in vivo overproduction of all enzymes contributing to the conversion of glucose to ethanol in the yeast Saccharomyces cerevisiae with the prospect of increasing ethanol formation. S. cerevisiae is probably the best studied eucaryotic organism with respect to both classical and molecular genetics. It turned out to be of great advantage that two different multi-copy-vectors could be employed in these studies. Each of them was used in the first part of the work to insert half of the set of genes intended for overexpression. The first genes were inserted by restriction and ligation and later on a combination of the PCR-technique, with which the genomic fragments of interest were amplified, and the efficient homologous recombination in vivo was used. With these methods, the gene encoding a hexose transporter (HXT1), all the genes encoding glycolytic enzymes (HXK2, PGI1, PFK1, PFK2, FBA1, TPI1, TDH1 bzw. TDH2, PGK1, GPM1, ENO2, PYK1), as well as the genes encoding enzymes needed for the conversion of pyruvate to ethanol (PDC1, ADH1), were cloned. Following the isolation from yeast, the plasmids were amplified in E. coli and characterized by restriction analysis. The measurement of specific enzyme activity in crude extract of yeast transformants with such plasmids showed a slight overproduction (factor 1,5 to 3,0) for all enzymes, except for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. For HXT1, an increased mRNA level (factor 14 in contrast to the control) was taken as evidence for overproduction. In the enzymatic determinations a clear tendency showing a lower overproduction with an increasing number of genes on the plasmids was observed. These findings suggest a negative feedback on glycolytic flux regulation. The the growth rates obtained in the second part of the work also showed a clear reduction with increasing numbers of plasmid-encoded genes. Regarding the physiological parameters, no changes in the coefficients for glucose consumption and ethanol formation could be found in comparison to a wild-type control, and the yield remained basically unchanged as well. Interestingly, abolishing the ATP-inhibition of phosphofructokinase by expression of a mutant allele of PFK1, resulted in a faster growth of transformants with an otherwise isogenic background. This result indicates the physiological relevance of the allosteric regulation at this essential glycolytic step. A lack of enzyme activity in one of the glycolytic steps in deletion mutants normally leads to growth inhibition on hexoses. On this basis, the construction of a yeast strain was initiated with the objective to obtain stable multi-copy transformants simply by growing cells on different sugars as carbon sources. In detail, this was done by crossing a strain carrying a pgi1-deletion with a strain carrying a pyk1-deletion followed by sporulation and tetrad dissection. Preliminary data with intermediate strain constructs indicate a clear increase in plasmid stability after growing cells on complex media.
From the results of this thesis, valuable insights into the regulation of the glycolytic flux in vivo can be deduced, which may serve as a basis for ongoing research on the improvement of ethanol formation by yeast.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Jürgen
Heinisch
Prof. Dr.
2006-09-08
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-1587
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2006/158/
oai:opus.uni-hohenheim.de:162
2007-01-09T09:46:43Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Die kleine GTPase RagA und der potentielle Pankreastumormarker TCTP, zwei Bindungspartner des Kerntransport-Proteins RanBP3
The small GTPase RagA and the potential pancreas tumour marker, two binding partners of the nuclear transport protein RanBP3
Schleicher Lilia
570
Tumormarker
GTPase , Bindungspartner , Kerntransport-Protein , RanBP3 , TCTP GTPase , binding partner , nuclear transport protein , RanBP3 , TCTP
RanBP3 ist eine Komponente des Crm1-vermittelten Proteinexports aus dem Zellkern. Seine Bindung verstärkt die Affinität des Crm1?RanBP3-Komplexes zu RanGTP und dem nukleären Transportgut. Nach der Translokation durch die Poren in das Zytoplasma zerfällt dieser Vierkomponenten-Komplex durch die gemeinsame Wirkung von RanBP1 und RanGAP. Ziel dieser Arbeit war es, durch Identifizierung neuer Bindungspartner das Kerntransport-Protein RanBP3 besser in etablierte Transportwege einzugliedern. Durch eine Zwei-Hybrid-Analyse wurden zwei neue Bindungspartner von RanBP3 identifiziert: die kleine GTPase RagA und das translational kontrollierte Tumorprotein (TCTP). Für die Bindung von RagA an RanBP3 sind ein kurzer carboxyterminaler Teil des RagA und der N-terminale Teil von RanBP3 ausreichend. Rekombinantes RagA wurde exprimiert. Durch in vitro Bindungs-Untersuchungen wurde die Interaktion zwischen RagA und RanBP3 bestätigt. Es wurde eine konkurrierende Bindung an den C-terminalen Teil des RanBP3 zwischen dem Exportin Crm1 und RagA gezeigt. Auch die Bindung des Guaninnukleotid-Austauschfaktors RCC1 an den RanBP3-Ran-Komplex verhindert die RagA-Bindung. Die intrazelluläre Lokalisation des RagA wurde mit Hilfe eines GFP-Fusionsproteins untersucht. GFP-RagA befindet sich vorwiegend im Kern und in Kernnähe. Ein Modell für den RagA-Import und -Export wurde vorgeschlagen. Die C-terminalen Aminosäurereste 100-172 von TCTP formen die Bindungsstelle von TCTP für RanBP3. Durch Northern-Blot-Analyse wurde gezeigt, daß TCTP in allen untersuchten Geweben in zwei mRNAs transkribiert wird. Das aus einer ovarialen cDNA-Bibliothek vervollständigte TCTP wurde kloniert und exprimiert. Mittels qPCR wurde gezeigt, daß die TCTP-mRNA zu der kleinen Gruppe mit sehr großer Kopienzahl pro Zelle gehört. Die Interaktion zwischen TCTP und RanBP3 wurde durch in vitro Bindung bestätigt. Es wurden polyklonale Antikörper gegen rekombinantes TCTP hergestellt. Die intrazelluläre Lokalisation wurde in indirekten Immunfluoreszenzstudien untersucht. In Cos7-Zellen befindet sich TCTP im Kern und der Kernumgebung. In humanen Zelllinien zeigte sich TCTP am stärksten in einem Bereich nahe der Kernmembran. Es wurde gezeigt, daß der TCTP-Spiegel in Pankreas-Tumoren erhöht ist. Auch eine Differenzierung von Pankreatitis und Pankreastumoren ist nach diesen Ergebnissen möglich. TCTP könnte zum Pankreas-Tumormarker oder zum Prognosefaktor für das duktale Adenokarzinom des exokrinen Pankreas werden.
RanBP3 is a component of the Crm1-mediated protein export from the nucleus. It favors the binding of export substrate to the RanGTP-Crm1 complex in the nucleoplasm. Upon translocation through the nuclear pore into the cytoplasm, the export complex is dissociated by RanBP1 and RanGAP. It was the objective of this thesis to advance the understanding of RanBP3 function by identifying novel binding partners. Using Yeast-Two-Hybrid Screening, two new interactors of nuclear protein RanBP3 were found, the small GTPase RagA and the translationally controlled tumour protein (TCTP). As a minimal requirement a short C-terminal part of RagA (residues 275-313) binds to the N-terminal region of RanBP3. Full length recombinant RagA was expressed. To substantiate the two-hybrid interactions, the binding of RagA to RanBP3 was verified by in vitro binding assays using recombinant proteins. RagA competes with exportin Crm1 for binding to RanBP3. Likewise, the nucleotide exchange factor for Ran, RCC1, binds to the RanBP3-Ran complex and inhibits RagA binding. Expression of GFP-fusion proteins established the cellular localisation of RagA in living and fixed cells. It is found predominantly in and at the nucleus. A model of RagA-import and -export is suggested. Residues 100-172 in the C-terminal part of TCTP form the binding site for its interaction with RanBP3. Using Northern Blot analysis, two mRNAs of TCTP were found in all human tissues examined. The TCTP sequence was completed using an ovarian cDNA library and the TCTP was cloned and expressed. By means of quantitative PCR it was shown that TCTP belongs to the small group of very abundant mRNA molecules in the cell. The TCTP-RanBP3 interaction was verified by in vitro binding assays using recombinant proteins. A polyclonal antibody to TCTP was generated. By using a GFP-TCTP fusion protein and anti-TCTP antibody the cellular localisation of TCTP was analysed. In Cos7-cells TCTP is found in and around the nucleus. In human cell lines most of the TCTP is localised at the nuclear membrane. Using specific anti-TCTP antibody it was shown that the TCTP level is increased in pancreatic tumours. A differential diagnosis of pancreatitis and pancreas tumour is feasible. TCTP has the potential to become a pancreatic tumour marker or a prognostic factor for ductal type adenocarcinomas of the exocrine pancreas.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Hans Konrad
Biesalski
Prof.
2006-11-22
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-1621
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2007/162/
oai:opus.uni-hohenheim.de:163
2007-01-09T11:42:47Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Ableitung von Restitutionspotenzialen als Entscheidungshilfe bei der Umsetzung von Moorschutzprogrammen
Derivation of restitution potential as a decision support for mire protection programs
Markus
Röhl
570
Landschaftspflege , Landschaftsplanung , Landschaftsökologie , Baar , NATURA 2000 , Biotopschutz , Hochmoor , Schwenninger Moos
Moorschutz , Restitution , Wiedervernässung Mire protection , restitution , rewetting
Baden-Württemberg besitzt als eines der letzten moorreichen Bundesländer der Bundesrepublik kein eigenständiges, naturschutzfachliches Programm zum Schutz seiner Moore. Aus diesem Anlass wurde eine Methodik zur Ableitung von Restitutionspotenzialen entwickelt, die als Steuerungselement bei der zukünftigen Umsetzung von Maßnahmen dienen soll. Dabei standen zentral folgende Fragestellungen im Mittelpunkt der Untersuchung: Welche Faktoren bedingen das Restitutionspotenzial eines Moores, beziehungsweise einer Teilfläche eines Moores? In welcher Form kann die Datenmatrix zur Ableitung des Restitutionspotenzials zusammengeführt werden, um zu einer transparenten Bewertung zu gelangen? Welche moorökologischen Daten sind landesweit in welcher Qualität vorhanden? Sind diese ausreichend, um zu einer Prioritätensetzung für Moorrestitutionen zu gelangen? Die Methodik wurde exemplarisch für das Naturschutzgebiet ?Schwenninger Moos? abgeleitet. Die Ergebnisse wurden anschließend auf den gesamten, umgebenden Naturraum, die Baar und Baaralb übertragen. Durch diese Verifizierung der Methodik konnten erhebliche Defizite im landesweiten Datensatz aufgezeigt werden. Als Grundlage zur Bewertung des Restitutionspotenzials wurden im Schwenninger Moos vor allem Daten zum Wasserhaushalt, Trophie und Arten und Biotopen erhoben. Der Wasserhaushalt des Schwenninger Mooses wurde dabei durch 34 Pegel dokumentiert. Besonders gut geeignet zur Charakterisierung der Standorte erwiesen sich dabei Halbjahresmediane und die kombinierte Betrachtung von Amplitude, Mittelwert und Tiefstwert. Die Trophie der Standorte wurde durch Messungen der Hauptnährstoffe, pH- und Leitfähigkeitswert sowie über Angaben zum C/N-Verhältnis verglichen.
Die Vegetation des Untersuchungsgebietes wurde vergleichend nach der Biotoptypenkartierung des Landes Baden-Württemberg, der Methodik zur Erfassung von Lebensraumtypen der FFH-Richtlinie sowie nach indikatorischen Artgruppen ausgewertet. Vor allem die Kartierung indikatorischer Artgruppen eignet sich zur Beurteilung des aktuellen Zustandes eines Moorkomplexes. Die vorliegenden Daten zur Torflagerstätte aus dem moorgeologischen Kataster wiesen ein hohes Alter auf. Deshalb wurden diese Daten durch Vergleichsbohrungen und kontinuierliche Messungen mittels Georadar überprüft. Dabei ergaben sich zum Teil erhebliche Differenzen zwischen den Angaben des moorgeologischen Katasters und den eigenen Untersuchungen. Die Ableitung des Restitutionspotenzials erfolgte durch die Kombination von drei Einzelbewertungen: Wiedervernässbarkeit, biotisches Potenzial und Umsetzungspotenzial. Diese drei Faktoren werden verbal-argumantativ abgeleitet und in einer fünf-stufigen Klassifikation zusammengeführt. Wesentliche Größe ist dabei die Wiedervernässbarkeit einer Fläche, die von Entwässerungseinrichtungen, Relief, Zustand der Torfe und dem Wasserdargebot abhängt. Das biotische Potenzial besteht aus dem Vorhandensein von Torfbildnern und den Auswirkungen einer Wiedervernässung. Das Umsetzungspotenzial ist im Wesentlichen von den herrschenden Nutzungen, Eigentumsverhältnissen und gesellschaftlichen Rahmenbedingungen abhängig.
Die Methodik wurde auf 34 Moorkomplexe der Baar und Baaralb übertragen. Die Identifizierung dieser Standorte war erst durch eine Zusammenführung unterschiedlicher Datensätze möglich. Es zeigte sich, dass das moorgeologische Kataster auf der Baar erhebliche Defizite bei der Ausweisung kleiner und flachgründiger Standorte aufwies. Nur 3 der 34 Standorte wiesen ein hohes Restitutionspotenzial auf. 23,5 % wurden mit einem mittleren Restitutionspotenzial eingestuft. Bei diesen Mooren handelt es sich im Wesentlichen um Naturschutzgebiete und flächenhafte Naturdenkmale. Ein geringes Restitutionspotenzial ist bei 38,2 % der Moorkomplexe vorhanden. Insgesamt 29,4 % der Moore wiesen kein Restitutionspotenzial mehr auf. Für die Umsetzung eines landesweiten Moorschutzprogramms sind im Rahmen der Untersuchung die wesentlichen Defizite aufgezeigt und Handlungsempfehlungen formuliert worden. Es muss primär ein aktualisiertes und vollständiges Moorkataster zur Verfügung stehen. In den naturschutzfachlich hochwertigen Moorkomplexen sollten zudem flächige Kartierungen der Vegetation und wertgebender Arten vorliegen. Es ist in diesem Zusammenhang ein Indikationsmodell von Vegetationseinheiten süddeutscher Moore anzustreben. Die Bearbeitung von Prioritätslisten sind von regionalen Expertengruppen für die jeweiligen Moorregionen oder Landkreise vorzunehmen.
As one of the last peatland-rich states of Germany, Baden-Württemberg possesses no self-standing, conservation program to protect its peatlands. Therefore, after consideration of the state administration, a strategy should be created in the next few years for a Baden-Württemberg peatland protection concept. With this in mind, a methodology for the derivation of peatland restitution potential was developed that can direct the future implementation of such a strategy. The exemplary methodology was developed for the nature conservation area ?Schwenninger Moos?, a medium sized former raised bog strongly disturbed by peat digging and agricultural amelioration. The results were applied to the entire surrounding bio-geographical region, the Baar and the Baaralb. Through this verification of the methodology, significant shortfalls in the state-wide dataset could become evident. As the basis of the evaluation of the restitution potential, data concerning the water level, trophy, and species and biotypes in Schwenninger Moos were collected. The water level of Schwenninger Moos was documented through 34 water gauges, the data from which was analysed through various methods. The half-year median and the combined examination of amplitude, average, and minimum values proved especially suitable for the characterisation of the sites. The trophic classifications of the sites were compared through measuring the principal nutrient levels, pH and conductivity values, as well as the C/N ratio. The vegetation of the investigation area was mapped and the results were subsequently compared to the mapping of biotypes of Baden-Württemberg, the mapping performed in the frame of Natura 2000, as well as that of indicator species groups. The mapping of indicator-species groups proved particularly suitable for the appraisal of the current status of a moor complex.
The available data on the mires from the peatland register of Baden-Württemberg were somewhat old (40 years). Therefore these data were verified through comparison-boring and continued measurement by means of georadar. Significant differences arose in a number of comparisons between the peatland register and the author?s investigations with respect to the positional accuracy and the stratum sequence. The derivation of the restitution potential was carried out through the combination of three separate assessments: rewetting-possibility, biotic potential, and conversion potential. These three factors were derived through verbal-argument and brought together in a simple, five-step classification. The rewetting-possibility of an area is the main factor determining the restitution, and it depends considerably on drainage systems, topography, condition of the peat, and the water level. The biotic potential consists of the presence of peat-producing plants and the effects of rewetting on populations of endangered species. The conversion potential is essentially dependent on the dominant uses, ownership and social framework. The methodology was applied to altogether 34 peatland complexes of the Baar and Baaralb. The identification of these locations was only possible by a laborious combination of the peatland register, pedological cartography and conservation-oriented publications. It was found that the peatland register exhibited substantial deficits regarding the classification of small and shallow-layered locations in the Baar. Data concerning vegetation and the occurrence of animals and plants were available for the derivation of the restitution potential. However, some of these proved too old and/or too inaccurate or not spatially verified. Little to no data were present as to the water balance and drainage systems.
Only three of the 34 locations exhibited a high restitution potential. 23,5% were classified as having moderate restitution potential; most of these sites are already under protection as nature conservation sites. A slight restitution potential was present in a total of 38.2% of the mire complexes, which consist mostly of small-scale spring mires and intensively agriculturally and silviculturally used locations. Likewise, 29.4% of the moorlands exhibited no more restitution potential. For the implementation of a state-wide mire protection program in the context of the investigation, the substantial deficits were pointed out and recommendations for action were formulated. Primarily, an updated and complete peatland register must be available. Furthermore, vegetation and endangered species maps of the entire peatland complexes protected as high conservation value areas should be available. It is in this regard that a system of indicator vegetation units of south German mires is to be aimed for, as is employed in northeast Germany, for example. Lists of priority sites should be made by regional teams of experts for the respective moor regions or administrative districts.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Reinhard
Böcker
Prof. Dr.
2005-12-21
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-1633
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Agrarwissenschaften
2
aus: Praesentationsformat
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2007/163/container.tgz
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2007/163/
oai:opus.uni-hohenheim.de:170
2008-04-24T09:34:50Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Funktionen charakteristischer Sequenzmotive endogener und toxischer mitochondrialer Proteine
Functions of characteristic sequence motives of endogenous and toxic mitochondrial proteins
Panagiotis
Papatheodorou
570
Mitochondrien
Proteinimport , EPEC , Zielerkennung , Carrier Signature mitochondria , protein import , EPEC , targeting , carrier signature
Mitochondrien nehmen im Zuge ihrer Biogenese ständig kernkodierte Proteine aus dem Cytosol auf. Der Proteinimport wird in der mitochondrialen Außenmembran von TOM-Proteinen, in der Innenmembran von TIM-Proteinen vermittelt. Mitunter gelangen auch toxische Proteine in die Mitochondrien, die von pathogenen Bakterien an die infizierten Gewebe abgegeben werden. Die vorliegende Dissertation liefert neue Erkenntnisse zur Rolle charakteristischer Sequenzmotive, die sich in endogenen und toxischen mitochondrialen Proteinen nachweisen lassen. In einem umfangreichen Projekt wurde die Bedeutung von Sequenzmotiven mitochondrialer Metabolit-Translokatoren in deren Biogenese und Funktion näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die positiv geladene N-terminale Präsequenz des Citrat-Translokators aus Rattus norvegicus nicht an der mitochondrialen Zielerkennung beteiligt ist sondern als internes Chaperon dient. Ein in allen Metabolit-Translokatoren konserviertes Sequenzmotiv, PX(D/E)XX(R/K), die Carrier Signature, stellt ebenfalls kein mitochondriales Zielerkennungssignal dar, wie anhand des Dicarboxylat-Translokators aus Saccharomyces cerevisiae nachge-wiesen werden konnte. Auch die Translokation über die Außenmembran, sowie die Insertion in die Innenmembran und die nachfolgende Dimerisierung des Dicarboxylat-Translokators ist von der Carrier Signature weitgehend unabhängig. Stattdessen wurde entdeckt, dass die Carrier Signature primär für die Funktion der Metabolit-Translokatoren in der Innenmembran der Mitochondrien notwendig ist. In einem weiteren Projekt wurde für das Map-Toxin enteropathogener Escherichia coli ? Stämme (EPEC) gezeigt, dass es unter Vermittlung seiner typischen N-terminalen Präsequenz unter Beteiligung der TOM- und TIM-Komplexe in die Matrix der Mitochondrien dirigiert wird. Das Map-Toxin löst dann unabhängig von der endogenen mitochondrialen Teilungsmaschinerie eine Fragmentierung des mitochondrialen Netzwerks und den Verlust des Membranpotentials aus. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass ein internes konserviertes WXXXE Sequenzmotiv für die Zytotoxizität des Map-Toxins im Cytosol und für die Spaltung der Mitochondrien essentiell ist. Vermutlich dient ein Lysinrest innerhalb der WXXXE-Sequenz als Sumoylierungsstelle. Die Untersuchungen zeigen, dass Mechanismen des intrazellulären Proteintransports nicht nur bei der Biogenese der Mitochondrien, sondern auch bei pathologischen Prozessen eine wichtige Rolle spielen können.
In the course of their biogenesis, mitochondria take up nuclear encoded proteins from the cytosol continuously. Protein import at the mitochondrial outer membrane is mediated by TOM proteins and by TIM proteins at the inner membrane, respectively. Now and then, toxical proteins released by pathogenic bacteria to infected tissue can also reach mitochondria. The present dissertation provides new findings on the role of characteristical sequence motifs that can be identified in endogenous and toxical mitochondrial proteins. In an extensive project the importance of sequence motifs from mitochondrial metabolite carrier proteins in their biogenesis and function was investigated in more detail. It could be shown, that the positively charged presequence of the citrate carrier from Rattus norvegicus is not involved in mitochondrial targeting but rather serves as an internal chaperone. A conserved sequence motif, PX(D/E)XX(R/K), the Carrier Signature, which can be found in all mitochondrial carrier proteins, does also not represent a mitochondrial targeting signal, as could be proven by using the dicarboxylate carrier from Saccharomyces cerevisiae as a model protein. Even the translocation across the outer membrane, the insertion into the inner membrane and the following dimerization of the dicarboxylate carrier are processes occuring independently of the Carrier Signature. Instead, it was discovered, that the Carrier Signature is primarily necessary for the function of metabolite carrier proteins in the inner membrane. In another project it could be shown for the Map toxin from enteropathogenic Escherichia coli strains (EPEC), that it is directed to the mitochondrial matrix, mediated by its typical N-terminal presequence and by the TOM and TIM complexes, respectively. The Map toxin leads then to the fragmentation of the mitochondrial network independent of the mitochondrial fission machinery and to the loss of the mitochondrial membrane potential. Moreover, it could be proven, that an internal conserved sequence motif, WXXXE, is essential for cytotoxicity of the Map toxin in the cytosol and for fission of mitochondria. A lysine residue within the WXXXE sequence serves probably as a locus of sumoylation. The investigations show, that mechanisms of intracellular protein transport are not only important for the biogenesis of mitochondria, but can also be relevant for pathological processes.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Joachim
Rassow
Prof. Dr. rer. nat.
2006-12-01
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-1706
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
2
aus: Praesentationsformat
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2007/170/container.tgz
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2007/170/
oai:opus.uni-hohenheim.de:169
2007-01-18T13:54:23Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Hydrostatic high pressure treatment of casein to generate defined particle and gel structures
Hydrostatische Hochdruckbehandlung von Casein zum Erzeugen definierter Partikel- und Gelstrukturen
Eva
Merel-Rausch
570
Casein , Hochdruck , Gel , Partikel , Teilchengröße , Micelle , Kraftmikroskopie , Viskosität
Voluminosität , Photonenkorrelationsspektroskopie , hydrodynamischer Durchmesser , Caseinmicellen , Hochdruckbehandlung Hig pressure treatment , particle size , viscosity , voluminosity , hydrodynamic diameter
The focus of the work was to study the influence of pressure treatment conditions on pressure-induced casein structures in detail. The influence of process parameters like pressure build-up, pressure level, holding time and release rate but also temperature, ionic strength and casein concentration were determined. This work showed that the structure formation of casein under high pressure treatment depends on numerous factors. Sols but also gels can be formed and could be used for different applications particularly with the choice of the release rate and the milieu conditions, even if pressure conditions and casein concentration are kept constant.
Ziel der Arbeit war es, die Druckbehandlungsbedingungen in ihrer Auswirkung auf die Strukturausbildung in Caseinsystemen im Detail zu untersuchen. Neben den Prozessparametern Druckaufbaurate, Druckhöhe, Haltezeit und Entspannungsrate wurde der Einfluss der Temperatur, der Konzentration an Casein aber auch des Ionenmilieus bei der Druckbehandlung untersucht. Mit der Arbeit wurde aufgezeigt, dass die Strukturierung von Casein als Resultat einer Hochdruckbehandlung von zahlreichen Faktoren abhängt. Insbesondere durch die Wahl der Entspannungsrate und der Milieubedingungen lassen sich bei ansonsten gleicher Druckbehandlungsbedingungen und Caseinkonzentration sowohl Sole als auch Gele für die unterschiedlichsten Applikationen erzeugen.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Jörg
Hinrichs
Prof. Dr.-Ing.
2006-12-08
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-1692
application/pdf
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
2
aus: Praesentationsformat
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2007/169/container.tgz
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2007/169/
oai:opus.uni-hohenheim.de:174
2007-02-27T15:52:16Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Mechanismen der Mastzellaktivierung durch gram-negative Bakterien und Bakterienprodukte aus der Darmflora.
Mechanisms of mast cell activation mediated by gram-negative bacteria and bacterial products derived from the intestinal flora.
Sigrid
Krämer
570
Mastzelle , Darm , Darmflora , Toll-like-Rezeptoren , Hämolysin
mast cells , intestine , intestinal flora , toll-like receptor , hemolysin
Die Rolle der Mastzelle (MC) als Effektorzelle in IgE-abhängigen Prozessen wie der Typ I Allergie ist seit langem bekannt. In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass MC in weitere pathophysiologische Prozesse wie der Tumorentwicklung, rheumatoiden Arthritis, chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED), Gewebsfibrose und Arteriosklerose involviert sind. Aber auch bei physiologischen Prozessen, z.B. der Abwehr von bakteriellen und parasitären Erkrankungen, der Wundheilung und Angiogenese sowie der Neuro-Immun-Interaktion, spielen MC eine Rolle. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle menschlicher Darm-MC bei der Immunantwort gegen Pathogene untersucht. Es wurden zwei Fragestellungen bearbeitet: 1. Exprimieren menschliche Darm-MC Toll-like Rezeptoren (TLR), die konservierte Strukturen von Bakterien und Viren erkennen, und sind sie durch TLR-Liganden aktivierbar? 2. Führt die Infektion menschlicher Darm-MC mit verschiedenen E. coli und Shigellen Stämmen zur Aktivierung und welche Mechanismen liegen dieser Aktivierung zugrunde?
Hierfür wurden MC mittels mechanischer und enzymatischer Aufbereitung aus der Mukosa chirurgischer Darmresektate isoliert. Nach Aufreinigung durch Positivselektion und mehrwöchiger Kultur betrug die MC-Reinheit 98-100%. Es konnte gezeigt werden, dass menschliche Darm-MC mRNA für TLR 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 und 9 exprimieren, allerdings tolerant gegenüber TLR-Liganden sind. Stimulation menschlicher Darm-MC mit LPS (Lipopolysaccharide, TLR 4 Ligand), LTA (Lipoteichonsäure, TLR 2 Ligand), Zymosan (TLR 2 Ligand), poly I:C (polyinosinic-polycytidylic acid, TLR 3 Ligand), R848 (TLR 7/8 Ligand), CpG (C poly G oligo-desoxy-nucleotide, TLR 9 Ligand) bzw. Non CpG führten weder zur Freisetzung von Histamin, Leukotrienen, TNF-alpha oder IL-8, noch zur mRNA-Expression von TNF-alpha oder IL-8. Ähnliche Ergebnisse wurden nach Infektion menschlicher Darm-MC mit dem Stuhlisolat E. coli (O101:H-) oder dem probiotischen Stamm E. coli Nissle 1917 beobachtet. Selbst die pathogenen Bakterien-Stämme, wie der invasive S. flexneri M90T und der FimH-exprimierende E. coli ORN 103(pSH2), induzierten keine signifikante Freisetzung der oben genannten Mediatoren. Zwar führten E. coli Stämme bei menschlichen Darm-MC zur Aktivierung der intrazellulären Signalmoleküle und Transkriptionsfaktoren ERK1/2, c-Fos und AP1. Diese Aktivierung reichte allerdings nicht aus, um eine vollständige Immunantwort auszulösen. Interessanterweise bewirkten die hämolytischen E. coli Stämme ATCC 25922 und 35218 eine starke Aktivierung menschlicher Darm-MC. Mit Hilfe isogener Hämolysin-negativer E. coli Mutanten und der Hämolysin positiven Transformante des probiotischen E. coli Nissle 1917 konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass menschliche Darm-MC sensible Effektorzellen für E. coli alpha Hämolysin sind. Sublytische Hämolysin Konzentrationen führten bei menschlichen Darm-MC über einen Kalzium-abhängigen Signalweg zur mRNA-Expression von TNF-alpha, IL-3, IL-5, IL-6, IL-8 und zur Freisetzung von Histamin und Leukotrienen. Der Einsatz von Inhibitoren intrazellulärer Signalmoleküle zeigte weiterhin, dass die durch Hämolysin bedingte Aktivierung der Zellen abhängig von L-Typ Kalzium Kanälen, Calcineurin und NFAT bzw. NFkappaB ist. Ansteigende Hämolysinkonzentrationen führten zur zweiten Phase der Aktivierung, die durch eine Lyse der Zellen gekennzeichnet war.
The role of mast cells (MC) as effector cells in IgE dependent processes like the type 1 allergy has been known for a long time. During the decade, it has been shown that MC are also involved in other pathophysiological processes such as mucosal polyposis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowl disease, tissue fibrosis, and atherosclerosis. Furthermore, MC play an important role in the regulation of host defense against microbes, tissue remodeling processes, and neuro-immunology-interaction. The first aim of the present study was to clarify the question whether human intestinal MC express toll-like receptors (TLR), which recognize conserved bacterial and viral components, and can MC be activated through TLR-ligands. The second major focus of the present study was to investigate if the stimulation of human intestinal MC with different E. coli and Shigella strains, respectively, results in an activation of MC and to identify the underlying mechanism(s). Accordingly, human intestinal MC were isolated from surgery tissue with a mechanical and enzymatical protocol. The purity of the MC cultures used in all experiments was between 98 and 100% which was achieved by positive selection (MACS). We could show, that human intestinal MC express mRNA for TLR 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, and 9. However, neither the stimulation with LPS (lipopolysaccharide, TLR 4 ligand), LTA (lipoteichoic acid, TLR 2 ligand), Zymosan (TLR 2 ligand), poly I:C (polyinosinic-polycytidylic acid, TLR 3 ligand), R848 (TLR 7/8 ligand), CpG (C poly G oligo-desoxy-nucleotide, TLR 9 ligand) and non CpG, respectively resulted in a release of histamine, leucotriens, TNF-alpha, or IL-8. Furthermore, mRNA expression levels of TNF-alpha and IL-8 were not induced by any of the treatments. Similar results where found when human intestinal MC were stimulated with E. coli (O101:H-) isolated from human faeces or the probiotic strain E. coli Nissle 1917. Even after stimulation with pathogenic bacteria strains such as the invasive S. flexneri M90T and the fimbriated E. coli, respectively, no induction of any of the parameters mentioned above was found. However, E. coli strains activate the intracellular signal molecule and transcription factors ERK1/2, c-Fos, and AP1, but this activation failed to induce a complete immune answer. In contrast, the hemolytic E. coli stains ATCC 25922 and ATCC 35218 provoked strong activation of intestinal MC. Using the isogenic hemolysin negative E. coli mutants and the hemolysin positive transformants of the probiotic E. coli Nissle 1917 it was shown, that human intestinal MC are sensitive target cells for E. coli alpha hemolysin. Stimulation of MC with sublytic concentration of hemolysin resulted in an induction of TNF-alpha, IL-3, IL-5, IL-6, IL-8 mRNA expression, the release of histamine as well as leucotrien. This activation was found to be regulated by calcium dependent signal cascades. Inhibition of intracellular signal molecules showed that the activation depends on L-typ calcium channels, calcineurin, NFAT and NFkappaB. Prolonged infection with hemolytic E. coli strains resulted in lysis of intestinal MC indicating a biphasic activation of hemolysin.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Stephan C.
Bischoff
Prof. Dr. med.
2006-12-15
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-1743
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2007/174/
oai:opus.uni-hohenheim.de:176
2007-05-23T16:51:29Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Olfaktorische Rezeptoren mit speziellen topographischen Expressionsmustern
Olfactory receptors with spezial Expressionpatterns
Torben
Feistel
570
Rezeptor
Olfaktorischer Rezeptor , Expressionsmuster olfactory receptor , expression pattern
In der vorliegenden Arbeit wurden olfaktorische Rezeptoren (OR) untersucht, die sich durch besondere Expressionsmuster in chemosensorischen Subsystemen auszeichnen. Es hat sich gezeigt, dass von den mehr als tausend OR Genen eine kleine Gruppe (etwa 50) nicht nur im olfaktorischen Epithel exprimiert wird, sondern auch im Vomeronasalorgan (VNO), das generell durch die Expression der Vomeronasal-Rezeptoren V1R und V2R charakterisiert. Die ?ektopisch? im VNO exprimierten OR Gene repräsentieren unterschiedliche Rezeptor-Familien und umfassen Gene aus unterschiedlichen Genclustern, die auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert sind. Allerdings wurde in allen untersuchten Individuen offenbar das gleiche ?Set? an Genen exprimiert. Die Mehrzahl der OR Gene wurde in relativ wenigen VNO Neuronen exprimiert, einige wenige Gene jedoch jeweils in mehr als 100 Zellen. Dabei wurde ein distinktes OR Gen (mOR261-6) im VNO weiblicher Tiere in deutlich mehr Zellen exprimiert als in dem männlicher Tiere. Die höchste Anzahl OR exprimierender VNO Neuronen war in einer kurzen postnatalen, präpubertären Phase zu beobachten. Für VNO Neurone, die den Rezeptor mOR18-2 exprimieren, konnte gezeigt werden, dass sie gleichzeitig ein V1R-Gen co-exprimieren. Für das OR Gen mOR18-2 wurde im Gegensatz zur typischen mono-allelischen Expression in den Sinneszellen des olfaktorischen Epithels in den Neuronen des VNOs die Expression von beiden Allelen (bi-allelisch) nachgewiesen. Die funktionellen Implikationen der Expression von zwei Rezeptortypen sind unklar. Die ausschließlich im olfaktorischen Epithel exprimierte Genfamilie der OR37 Rezeptoren zeichnet sich ebenfalls durch ein besonderes topographisches Expressionmuster aus. Diese Gene werden nur in Zellen exprimiert, die in einem zentralen, eng umgrenzten Areal der nasalen Turbinalen lokalisiert sind. Detaillierte Analysen zum Expressionsmuster von distinkten OR37-Subtypen ergaben charakteristische Subkompartimentierungen in diesem zentralen Zellcluster. Die relativ hohe Zahl von OR37 exprimierenden Zellen in diesem zentralen Epithelareal resultiert in einer deutlich geringeren Zelldichte für andere Rezeptortypen in dieser Region; d.h. Zellen in diesem epithelialen Areal exprimieren bevorzugt OR37 Gene. Die Mechanismen, die zur Ausbildung dieses speziellen Expressionsmusters im OE führen sind bisher unbekannt. Analysen einer neuen transgenen Mauslinie, in der alle Zellen, die ein definiertes Mitglied der OR37 Genfamilie zur Expression auswählen permanent markiert werden, haben gezeigt, dass die Transkription von OR37 Genen auch in Zellen außerhalb des ?Clusters? induziert werden kann; in diesen Regionen wird die Expression offenbar kurzfristig wieder beendet. Diese Befunde sprechen dafür, dass die geclusterte Organisation von OR37 exprimierenden Sinneszellen auf einen Mechanismus zurückzuführen ist, der eine Initiation der Transkription von OR37 Genen in verschiedenen Arealen des Epithels ermöglicht, die Aufrechterhaltung der Transkriptionsprozesse aber exklusiv auf den zentralen Turbinalbereich beschränkt. Die einzigartigen Eigenschaften der OR37 Rezeptoren führten zur Annahme, dass sie u.U. auf chemische Verbindungen reagieren die für Säuger besonders relevant sind. Daher wurden flüchtige Verbindungen aus komplexen Gemischen chemischer Komponenten aus dem unmittelbaren Lebensraum von Mäusen untersucht. Elektro-Olfaktogramme von verschiedenen Regionen des Riechepithels haben gezeigt, dass ?head-space? von Einstreu im zentralen Bereich des Turbinals IIb eine stärkere elektrische Antwort auslöste als in anderen Epithelbereichen. Einzelne Verbindungen aus dem Gemisch lösten in verschiedenen Epithelabschnitten vergleichbare elektrische Antworten aus; allerdings wurde für 6-Hydro-6-methl-3-heptanon eine stärkere Reaktion in der zentralen Turbinalregion registriert; diese Verbindung wird als ein Pheromon von Mäusen betrachtet. Die Daten zur Expression und zum Reaktionspektrum distinkter olfaktorischer Rezeptoren unterstützen die These, dass VNO und olfaktorisches Epithel zwar strukturell separate Systeme darstellen, ihre Reaktionsspektren und Funktionen allerdings überlappen, insbesondere bei der Registrierung von komplexen Substanz-Gemischen mit weitreichender biologischer Relevanz.
In the present study, olfactory receptors (ORs) featuring special expression patterns in chemosensory subsystems were analyzed. The data showed that out of a repertoire of about 1000 ORs a restricted group (about 50) was not only expressed in the olfactory epithelium but also in the vomeronasal organ, which is generally defined by the expression of characteristic V1R and V2R receptors. The ?ectopically? expressed OR genes represent different receptor families including genes from gene-clusters located on different chromosomes. However, in all individuals the same set of genes seemed to be expressed. The majority of the expressed ORs was present in only a small number of VNO cells, however some were found to be expressed in more than 100 cells. One distinct OR gene (mOR261-6) was expressed in many more cells of female VNOs than in males. The highest number of OR expressing cells was observed in a short postnatal, pre-pubertal period. Cells with mOR18-2-receptors were also found to express a V1R gene. In these cells the OR18-2 gene did not show a mono-allelic expression as compared to expression in the main olfactory system but rather was transcribed from both alleles (bi-allelic) in the vomeronasal neurons. The functional implication of receptor coexpression and bi-allelic OR-expression are unknown. Receptors of the OR37 gene family are exclusively expressed in the olfactory epithelium, in which they are expressed in a special pattern in a central area of the nasal turbinate. Detailed analysis of the spatial distribution of cells equipped with distinct OR37 subtypes revealed that these cells were positioned in specific sub-compartments within this central region. The high number of OR37 expressing cells resulted in the lower number of cells with receptors which are zonally distributed. This implies that cells in a small circumscribed area preferentially expressed OR37 genes. The mechanisms underlying this unique spatial expression pattern of OR37 genes in the olfactory epithelium are currently unknown. A newly generated mouse line was arranged in which even very transient transcription of a OR37 gene is visualized by permanent label in the expressing cells. The examination showed that cells outside of the OR37 cluster did express a OR 37 family member, yet transcription in these cells was rapidly terminated. These results suggest a mechanism which allows an initial transcription of these genes in different areas of the epithelium, but a sustained expression of OR37 genes is restricted exclusively to the central recess of the turbinate. The special features of the OR37 subtypes have led to the hypothesis that these receptors possibly react to chemical compounds relevant for mammalian species. Thus complex mixtures of volatile compounds from the habitat of mice were examined. Electroolfactograms from different regions of the olfactory epithelium showed that the ?head-space? of the embedding from mice cages elicited a stronger response in the central area of the turbinate IIb than in areas outside of this region. Single substances out of this complex mixture induced similar responses in different epithelial recesses. However, 6-hydro-6-methyl-3-heptanon elicited stronger responses within the central OR37 expressing region. This substance is considered to be a mouse pheromone. Taken together, these data on expression and ligand specificity of distinct olfactory receptors suggest, that the vomeronasal organ and the olfactory epithelium although structurally separated chemosensory systems, overlap in their response, spectrum and in their functions, particularly in detecting compounds with biological relevance.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Heinz
Breer
Prof. Dr.
2007-01-30
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-1762
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2007/176/
oai:opus.uni-hohenheim.de:177
2008-04-24T09:40:44Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Determination of Laterality in the Rabbit Embryo: Studies on Ciliation and Asymmetric Signal Transfer
Ausbildung von Lateralität im Kaninchenembryo: Studien zu Ciliogenese und asymmetrischem Signaltransfer
Kerstin
Feistel
570
LR-Asymmetrie
Cilien , Kaninchen , Nodal , FGF8 , Gap junctions Cilia , Rabbit , Nodal , FGF8 , Gap junctions
The midline of the vertebrate embryo plays a pivotal role in the regulation of left-right (LR) asymmetry. In mammals recent interest has focused on a structure situated at the caudal part of the notochord, the posterior notochord (PNC), which is homologous to Kupffer?s vesicle (KV) in fish and the gastrocoel roof plate (GRP) in frog. Despite highly diverging embryonic architecture, the PNC/KV/GRP is the site where motile monocilia set up a directional fluid flow, an event indispensable for the generation of LR asymmetry. Signals created at the PNC/KV/GRP need to be transferred to the periphery of the embryo, where they initiate the left-specifying program in the left lateral plate mesoderm (LPM). In this study morphogenesis and ciliogenesis of the notochordal plate as well as the signaling processes between midline and LPM were studied in the rabbit embryo. Rabbit development progresses through a flat blastodisc phase and represents the typical mode of mammalian embryogenesis. Transcription of ciliary marker genes, the first sign of beginning ciliogenesis, initiated in Hensen?s node and persisted in the nascent notochord. Cilia emerged on cells leaving Hensen?s node anteriorly to form the notochordal plate. Cilia lengthened to about 5µm and polarized from an initially central position to the posterior pole of cells. Electron microscopic analysis revealed 9+0 and 9+2 cilia and a novel 9+4 axoneme intermingled in a salt-and-pepper-like fashion. These data showed that the ciliogenic gene program essential for laterality determination is conserved at the midline of the rabbit embryo. The present study also provided evidence that initiation as well as repression of the Nodal cascade crucially depended on communication between midline and lateral plate (LP). Separation of LP tissue from the midline before, during and after the 2 somite stage demonstrated that signals from the PNC induced and maintained the competence of LPM to express Nodal. Signals from the midline were necessary after the 2 somite stage to maintain a right-sided identity, i.e. absence of Nodal expression. Gap-junction-dependent intercellular communication (GJC) was shown to play a central role in this process. Previously, GJC had been involved in LR axis determination in cleavage stage frog embryos and early blastodisc stages in chick. This study for the first time demonstrates the role of GJC in mammalian embryos. GJs regulate the signaling between midline and periphery: permeable gap junctions were required specifically at the 2 somite stage to repress Nodal induction in the right LPM, whereas closed GJs were a prerequisite for Nodal signaling on the left side. Establishment of the right-sided fate depended on FGF8, the signaling of which was regulated by the opening status of GJs. A 3-step model is proposed for symmetry breakage and induction of the LR signaling cascade in vertebrates: (1) Nodal protein synthesized at the lateral edges of the PNC diffuses bilaterally and confers competence for the induction of the Nodal cascade to the LPM, (2) at the same time the left-specific cascade is actively repressed by action of the GJC/FGF8 module, and (3) following the onset of leftward flow at the PNC repression gets released specifically on the left side at the 2 somite stage, presumably by transient inhibition of GJC. This model not only is consistent with the presented data, but also with published work in other model organisms.
Im Wirbeltierembryo spielt die Mittellinie eine wichtige Rolle bei der Ausbildung der links-rechts (LR) Asymmetrie der inneren Organe. Das jüngste Interesse fokussiert sich insbesondere auf den caudalen Teil des Notochords im Säuger, das posteriore Notochord (PNC), eine Region die dem Kupfferschen Vesikel (KV) des Fisches und der Dachplatte des Gastrocoels (GRP, gastrocoel roof plate) der Amphibien homolog ist. Trotz der höchst unterschiedlichen Morphologie der Wirbeltierembryonen zeich-net sich die PNC/KV/GRP-Region immer dadurch aus, dass hier ein durch Mono-cilien getriebener gerichteter Flüssigkeitsstrom entsteht, welcher für die Entstehung von Asymmetrie unverzichtbar ist. Signale, die in diesem Bereich der Mittellinie entstehen, müssen in die Peripherie des Embryos gelangen, um die links-spezifische Signalkaskade im linken Seitenplattenmesoderm (SPM) in Gang zu setzen. In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl die Morphogenese und Ciliogenese der Notochordalplatte als auch die Signalprozesse zwischen Mittellinie und Seitenplatte im Kaninchenembryo untersucht. Die Entwicklung des Kaninchens durchläuft ein flaches Keimscheibenstadium und repräsentiert somit die grundlegende Morphologie der Säugerentwicklung. Die Transkription ciliärer Markergene, das erste Zeichen der Ciliogenese, begann im Hensenschen Knoten und setzte sich im auswachsenden Notochord fort. Die ersten Cilien entstanden auf Zellen, die den Knoten als Teil der Notochordalplatte rostralwärts verließen. Diese Cilien wuchsen zu etwa 5µm Länge heran und nahmen sukzessive eine posteriore Position auf der Zelle ein. Die Analyse der Cilien im Elektronen-mikroskop zeigte, dass 9+0 und 9+2 Cilien sowie ein neu entdecktes 9+4 Axonem auf der Notochordalplatte vermischt vorkamen. Diese Daten bestätigten, dass das genetische Programm, welches die Ciliogenese steuert und für die Ausbildung der Organasymmetrie verantwortlich ist, in den Strukturen der Mittellinie des Kaninchens konserviert ist. Die vorliegende Arbeit zeigte zudem, dass sowohl Induktion als auch Repression der Nodal-Signalkaskade auf einem Austausch zwischen Mittellinie und Seitenplatte (SP) beruhen. Die Isolierung von SP-Gewebe vor, während und nach dem 2-Somiten-Stadium bewies, dass Signale aus dem PNC die Kompetenz zur Expression von Nodal im SPM induzierten und aufrecht erhielten. Nach dem 2-Somiten-Stadium waren Signale aus der Mittellinie notwendig, um die Identität der rechten Seite, d.h. fehlende Nodal-Expression, aufrecht zu erhalten. Es stellte sich heraus, dass gap-junction-vermittelte interzelluläre Kommunikation (GJK) eine zentrale Rolle in diesem Prozess spielt. Es ist bereits bekannt, dass GJK in Furchungsstadien von Froschembryonen sowie in der frühen Keimscheibe des Hühnchens an der Ausbildung der LR Asymmetrie beteiligt sind. Nun zeigt diese Arbeit zum ersten Mal, dass GJK auch im Säuger eine Rolle spielt. Gap junctions (GJs) regulieren den Signalaustausch zwischen Mittellinie und Peri-pherie: permeable GJs waren speziell im 2-Somiten-Stadium zur rechtsseitigen Repression von Nodal im SPM benötigt, während geschlossene GJs eine Vorauss-etzung für die Induktion von Nodal auf der linken Seite bildeten. Die Identität der rechten Seite war zudem von FGF8 abhängig, dessen Funktion durch den Öffnungs-status der GJs reguliert wurde. Ein dreistufiges Modell für den Symmetriebruch und die Induktion der LR Signalkaskade in Wirbeltieren wird vorgeschlagen: (1) Nodal-Protein breitet sich beiderseits des PNC aus und überträgt die Kompetenz für die Nodal-Kaskade auf das SPM. (2) Die links-spezifische Kaskade wird durch das Zusammenspiel von GJK und FGF8 beidseitig aktiv unterdrückt bis (3) die linksgerichtete Flüssigkeitsbewegung diese Repression auf der linken Seite aufhebt, wahrscheinlich durch eine vorübergehende Inhibition von GJK. Das vorgeschlagene Modell stimmt nicht nur mit den hier präsentierten Daten, sondern auch mit bereits veröffentlichten Arbeiten an anderen Modellorganismen überein.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Martin
Blum
Prof. Dr.
2007-01-30
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-1776
application/pdf
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2007/177/
oai:opus.uni-hohenheim.de:189
2008-04-24T09:45:29Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Vergleichende Untersuchungen zur Musterbildung in erregbaren Medien mit Vermerken zum Einfluss schwacher magnetischer Felder - Schwerpunkt: Belousov-Zhabotinsky-Reaktion
Analysis on the creation of patterns in excitable media with remarks to the influence of weak external magnetic field - focal point: Belousov-Zhabotinsky reaction
Kerstin
Dolzmann
570
Belousov-Zabotinskij-Reaktion , Musterbildung
erregbare Medien, schwache externe Kräfte, Magnetfelder, Ferrofluide, Neurophysiologie Belousiv-Zhabotinky reaction, creation of pattern, weak externe forces, magnetic field
In der Arbeit wurde der Einfluss eines schwachen magnetischen Feldes (MF) auf die Musterbildung erregbarer Medien untersucht (Gleichspannungs- (DC) und Wechselspannungsfelder (AC)). Als Beispielmodelle dienten die Belousov-Zhabotinsky-Reaktion (BZR) und Ferrofluide. Die durch vertikale Vibration angeregten Ferrofluide zeigen bei Erhöhung der zugefügten Energie (Vergrößerung der Amplitude) Phasenübergänge in ihrer Musterbildung. Im DC-Feld erhöhte sich die Viskosität der magnetischen Flüssigkeit, wodurch die Phasenübergänge verschoben werden. Eine nicht-stationäre, gerührte BZR zeigt einen periodischen Farbwechsel zwischen gelb und farblos ? oder rot und blau, wenn man sie um den Katalysator Ferroin ergänzt. Diese Oszillation wird in der Literatur als einfache Kurve dargestellt. Im Versuch konnte aber ein weitaus komplexerer Kurvenverlauf aufgezeichnet werden. Die intrinsischen optischen Signale (IOS) einer Ferroin-katalysierten, gerührten BZR wiesen zu Beginn der Reaktion Doppelpeaks auf, die nach einigen Oszillationen wieder verschwanden. Dieses Verhalten ist in seinem Auftreten abhängig von der Ferroin-Konzentration und gleicht den elektrischen und optischen Signalen neuronaler Gewebe (z.B. retinale spreading depression). Diese Ähnlichkeit untermauert die bisherige Verwendung der BZR als Modellsystem für die Erforschung neuronaler Vorgänge, auch wenn die dahinter liegenden Mechanismen vollkommen unterschiedlich sind.
Setzt man dieses System dem Einfluss eines schwachen magnetischen DC-Feldes aus, kommt zum Doppelpeak eine weitere interne Oszillation der IOS-Kurve hinzu. Auch verhält sich der Doppelpeak selbst anders als ohne externes Feld. Bei weiterer Erweiterung, z.B. durch die Erzeugung kleiner Ströme in einem elektromagnetischen AC-Feld, geht das System dann langsam in ein chaotisches Verhalten über. Jedes Hinzfügen einer zusätzlichen Komponente hat eine erneute Bifurkation des Systems zur Folge und führt letztendlich ? so vermuten wir ?zum Übergang des Musters ins Chaos. BZR-Gele zeigen helle propagierende konzentrische Ringe oder Spiralen als Muster. Mit den verwendeten Messmethoden und ?Geräten konnte keine Veränderungen im Muster beobachtet werden, wenn das System um Komponenten erweitert wurde. Man kann aber vermuten, dass sich im DC-Feld das zeitliche Verhalten der Gele verändert: Es scheint insgesamt schneller zu werden.
In this work we did some research on the influence of a weak external magnetic field (MF) on the creation of patterns in excitable media (duration field (DC) and alternating field (AC)). As examples we chose the well known Belousov-Zhabotinsky reaction (BZR) and ferrofluids. If ferrofluids are stimulated mechanically by vertical vibration they show changes of phases in the building of patterns while raising the induced energy (here by different hights of amplitudes). The viscosity of the magnetic fluid is increasing in a DC-field. Because of this the changing of the phase is different from the ones without an external force. A non-stationary stirred BZR shows a periodic change of colour between yellow and colourless ? or red and blue, if ferroin is added as a catalyst. This oscillation is described as a simple curve in literature. We, however, found a much more complex behaviour in the experiment. The intrinsic optical signals (IOS) of a ferroin-catalysed, stirred BZR show a double-peak at the beginning of the reaction, which is fading after a few further oscillations. This behaviour depends on the concentration of ferroin and resembles very much electrical and optical signals known from neuronal processes (e.g. retinal spreading depression). This basic similarity makes the BZR an ideal model for a variety of neurophysiological signals, even if the underlying mechanisms are completely different. If this system is put to the influence of a weak external magnetic DC-field a further inner oscillation is added to the double-peak behaviour of the IOS. Also the double-peak itself looks different from the one without external field. If further components are added to the system it gradually changes to chaotic behaviour. This could be the induced little currents in an AC-field. Each expansion of the system is followed by further bifurcation culminating in a transition from pattern to chaos. BRZ gels show bright propagating concentric rings or spirals as a pattern. With the used materials and methods of measurement we were not able to record changes in the formation of patterns if the system was expanded. But one can assume that the behaviour of the gel is changing in the DC-field: all in all it seems to get faster.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Wolfgang
Hanke
Prof. Dr.
2007-02-26
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-1896
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2007/189/
oai:opus.uni-hohenheim.de:194
2008-04-24T09:50:25Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Improving food safety of sprouts and cold-smoked salmon by physical and biological preservation methods
Verbesserung der Lebensmittelsicherheit von Keimlingen und Räucherlachs durch physikalische und biologische Konservierungsmethoden
Alexander
Weiss
570
Keimlinge , Räucherlachs , Salmonella , Lebensmittelsicherheit , EHEC , Listeria monocytogenes , Konservierung
Lebensmittelsicherheit, Keimlinge, Lachs, Salmonellen, Listeria monocytogenes food safety, sprouts, biopreservation, salmon, ready-to-eat
Die Lebensmittelmittelsicherheit von rohen, verzehrsfertigen Lebensmitteln ist von überragender Bedeutung was Lebensmittelherstellern, Verbrauchern sowie Lebensmittelwissenschaftlern bewusst ist. Um den Status der Lebensmittelsicherheit zu verbessern, ist die Dekontamination durch Waschen mit heissem Wasser ein wichtiger Prozessschritt; hinzu kann der Einsatz von Schutzkulturen als biologisch wirksames Agends vielversprechendes Verfahren kommen. In unserer Arbeit haben wir diese Strategien erfolgreich bei roh zu verzehrenden Keimlingen und Räucherlachs angewandt. Somit wurden die gesetzten Ziele erfolgreich ausgeführt und wesentliche wissenschaftliche Erkenntnisse beigetragen. Die Ergebnisse sind publiziert und werden nachfolgend in Form der veröffentlichten Zusammenfassungen beschrieben.
Thermische Behandlung von Saaten um den Status der Lebensmittelsicherheit zu verbessern: Alexander Weiss and Walter P. Hammes. 2003. Thermal seed treatment to improve the food safety status of sprouts. (Journal of Applied Botany. 77: 152-155)
Die Wirksamkeit der Hitzebehandlung zur Reduktion von Salmonellen und Escherichia coli O157:H? auf Luzerne-, Mungobohnen- und Rettichsaaten mit Anwendung bei der Erzeugung von Keimlingen: Weiss Alexander and Hammes, Walter P. 2005. Efficacy of heat treatment in the reduction of salmonellae and Escherichia coli O157:H? on alfalfa, mung bean and radish seeds used for sprout production. (Eur. Food Res. Tech. 211, 187-191)
Charakterisierung der Mikroflora von Keimlingen und ihr Potential für die Anwendung als Schutzkultur: Alexander Weiss, Christian Hertel, Silke Grothe, Diep Ha and Walter P. Hammes 2006. Characterization of the microbiota of sprouts and their potential for application as protective cultures. (Applied and Environmental Microbiology. Submitted for publication)
Milchsäurebakterien als Schutzkultur gegen Listeria spp. auf kalt geräuchertem Lachs: Weiss Alexander and Hammes, Walter P. 2006. Lactic acid bacteria as protective cultures against Listeria spp.on cold-smoked salmon. (Eur. Food Res. Tech. 222, 343-346)
The safety of raw, ready-to-eat foods is of paramount importance and is in the focus of the food industry, consumers as well as food scientists. To improve the food safety status of the products, efficient decontamination as an important processing step and/or the use of protective microorganisms as biocontrol agents are promising approaches. In our work we successfully used these approaches for raw sprouts and cold-smoked salmon as examples for RTE foods. Therefore the set goals have been successfully performed and essential scientific knowledge has been contributed. The results have been published and are described in the following in form of the respective abstracts.
Thermal seed treatment to improve the food safety status of sprouts: Alexander Weiss and Walter P. Hammes. 2003. Thermal seed treatment to improve the food safety status of sprouts. (Journal of Applied Botany. 77: 152-155)
Efficacy of heat treatment in the reduction of salmonellae and Escherichia coli O157:H? on alfalfa, mung bean and radish seeds used for sprout production:
Weiss Alexander and Hammes, Walter P. 2005. Efficacy of heat treatment in the reduction of salmonellae and Escherichia coli O157:H? on alfalfa, mung bean and radish seeds used for sprout production. (Eur. Food Res. Tech. 211, 187-191)
Characterization of the microbiota of sprouts and their potential for application as protective cultures: Alexander Weiss, Christian Hertel, Silke Grothe, Diep Ha and Walter P. Hammes 2006. Characterization of the microbiota of sprouts and their potential for application as protective cultures. (Applied and Environmental Microbiology. Submitted for publication)
Lactic acid bacteria as protective cultures against Listeria spp.on cold-smoked salmon: Weiss Alexander and Hammes, Walter P. 2006. Lactic acid bacteria as protective cultures against Listeria spp.on cold-smoked salmon. (Eur. Food Res. Tech. 222, 343-346)
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Walter
Hammes
Prof.
2007-03-30
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-1946
application/pdf
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2007/194/
oai:opus.uni-hohenheim.de:210
2007-10-24T14:58:41Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Zelluläre Mechanismen beim Neuro Tissue-Engineering
Cellular mechanisms in neuro tissue-engineering
Lars
Dreesmann
570
Schwann-Zelle , Fibroblast , Implantat , Angiogenese
Implantat, Schwann Zelle, Fibroblasten, in vivo Schwann cell, fibroblast, angiogenesis, implant, in vivo
Die primäre epineurale Nervennaht und die Verwendung von autologen Nerventransplantaten bilden zurzeit die Methoden der Wahl bei der Behandlung von Verletzungen im peripheren Nervensystem. Durch die Bereitstellung einer möglichst nativen Struktur, in der sowohl Schwann Zellen als auch Endothelzellen vorhanden sind, wird eine optimale Versorgung regenerierender Axone gewährleistet. Da dieses Therapiekonzept aber gewisse Risiken birgt, wird weltweit intensiv an anderen Möglichkeiten zur Behandlung solcher Verletzungen geforscht.
Eine wichtige Rolle spielen dabei Schwann Zellen, die durch Migration entlang der Läsion eine Leitstruktur, die Büngnerschen Bänder, bilden. Diese bietet den auswachsenden Axonen ein optimales Substrat. Antagonistisch wirkende Fibroblasten sind in der Lage diese Prozesse wesentlich zu behindern. Daher wurde zunächst die Kommunikation dieser Zelltypen genauer analysiert, wobei der Fokus auf der Migration lag. Es konnte gezeigt werden, dass die Migration der Schwann Zellen durch Fibroblasten verbessert wird. Als molekularer Mediator für diesen Effekt wurde der Faktor Neuregulin identifiziert. In weiteren Versuchen konnte festgestellt werden, dass Neuregulin die Migration von Schwann Zellen über den erbB-Rezeptor und die RhoA Signalkaskade beeinflusst.
Für das Konzept der Nervenleitschiene bedeutet dies, dass die Innenmembran die Diffusion von Stoffen ermöglichen, und gleichzeitig Regenerations-hemmende Fibroblasten aus dem Inneren der Leitstruktur ausschließen soll. Dazu wurden zunächst Gelatinembranen hinsichtlich ihrer physikalisch-chemisch Eigenschaften charakterisiert. Mittels zellbiologischer Tests wurde dann die Permissivität für Schwann Zellen, Semipermeabilität für Nährstoffe und Ausschluss-eigenschaften für infiltrierende Fibroblasten an Gelatineröhren getestet.
Da eine verbesserte Versorgung mit Nährstoffen eine zusätzliche Beschleunigung der Regeneration verspricht, sollte die Bildung von Blutgefäßen um die Leitstruktur durch eine Schwammmatrix gefördert werden. Dabei wurde das Einwandern von Blutgefäß-bildenden Endothelzellen mittels verschiedener immunzytochemischer und mikroskopischer Verfahren charakterisiert. Auf der Chorioallantoismembran des Hühnereis und mittels subkutaner Implantation bei der Maus wurde in vivo die Neovaskularisation, die Biokompatibilität sowie die Inflammation analysiert. Die Implantation zwischen den Enden des läsionierten Nervus ischiaticus der Ratte zeigte in histologischen Analysen dabei eine Verbesserung der Angiogenese und keine Immunreaktion.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte unter Verwendung zahlreicher molekular- und zellbiologischer Versuche, sowie dreier Tiermodelle ein Beitrag zum vertieften Verständnis von Mechanismen während der Neuroregeneration, und ein transdisziplinärer Brückenschlag zwischen Materialwissenschaft und Biologie bei der Entwicklung innovativer Therapiekonzepte geleistet werden.
To date, numerous tissue engineering approaches aim to develop artificial nerve guide implants for the treatment of lesioned nerves. However, the gold standard in this therapeutical application is still the autologous nerve transplantation. By allocation of a native structure, comprising Schwann cells as well as endothelial cells, an optimal supply of regenerating axons is warranted. Because this surgical procedure retrieves several risks, intensive research is done worldwide to develop alternatives.
In this context, Schwann cells play an important role. By migration along the lesion site, they built up guidance rails, so called bands of Büngner. These bands offer an ideal substratum for regrowing axons. However, antagonistic fibroblasts may hamper these events. Hence, the interaction between the two cell types was analyzed in detail, setting a focus on migration. Results indicated that fibroblasts foster Schwann cell migration. Neuregulin was identified as molecular mediator causing this effect. Further experiments revealed that neuregulin promotes Schwann cell migration via erB-receptor and the RhoA pathway.
With respect to the concept of a nerve guide implant this means, that the inner membrane should allow diffusion of growth factors, but exclude regeneration inhibiting fibroblasts from the inside. For this purpose, gelatin membranes were characterized regarding their physical and chemical properties. Cell biological testing with gelatin tubes shed light on permissivness for Schwann cells, semipermeability for nutrients and exclusion of fibroblasts.
Because a better supply with nutrients promises an additional acceleration of regeneration, the formation of blood vessels next to the implant should be promoted by a gelatin sponge. The immigration of blood vessel forming endothelial cells was analyzed using immunocytochemistry and microscopy. Neovascularisation, biocompatibility and inflammation were investigated on the chorioallantoic membrane of the chicken egg, as well as with subcutaneous implantation into mice. Implantation of gelatin nerve guide tubes in lesioned rat sciatic nerves showed an increased angiogenesis and hardly any inflammation.
Within the scope of this work, the application of several molecular and cell biological assays, in combination with three different animal models, made a contribution to the detailed comprehension of mechanisms during nerve regeneration, together with an interdisciplinary bridging between material science and biology in development of innovative therapeutical approaches.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Burkhard
Schloßhauer
Prof. Dr.
2007-09-05
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-2100
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2007/210/
oai:opus.uni-hohenheim.de:212
2007-12-12T14:21:06Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Eliminierung apoptotischer Zellen durch professionelle Phagozyten: Generierung, Freisetzung und Erkennung des monozytären Attraktionssignals Lysophosphatidylcholin und Bedeutung von Annexin I als Brückenprotein in der phagozytotischen Synapse
Elimination of apoptotic cells by professional phagocytes: Generation, release and recognition of the monocytic attraction signal lysophosphatidylcholine and importance of annexin I as a bridging protein in the phagocytic synapse
Michaela
Waibel
570
Apoptosis , Phagozytose , Clearance , Chemotaxis , Phospholipase A2 , Annexin I , Autoimmunität
ABCA1 , G2A , Attraktionssignal apoptosis , phagocytosis , attraction signal , clearance
Die effiziente Eliminierung apoptotischer Zellen durch Phagozyten ist essentiell für die Aufrechterhaltung der Gewebshomöostase in mehrzelligen Organismen. Dazu werden von apoptotischen Zellen verschiedene Phagozytose- oder ?eat-me?-Signale auf der Oberfläche präsentiert, die für die Erkennung und Internalisierung entscheidend sind. In höheren Organismen sind die sterbenden Zellen und die Phagozyten jedoch oft nicht direkt nebeneinander lokalisiert; deshalb kommt hier der Freisetzung von löslichen Attraktionssignalen eine besondere Bedeutung zu. Als ein zentrales ?find-me?-Signal konnte Lysophosphatidylcholin (LPC) identifiziert werden, das durch die hydrolytische Spaltung von Phosphatidylcholin mittels der Calcium-unabhängigen Phospholipase A2 (iPLA2) entsteht. Dabei wird die iPLA2 während der Apoptose Caspase-3-abhängig gespalten. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Prozessierung von iPLA2 direkt durch Caspase-3 geschieht und zu deren Aktivierung führt. Die aktive iPLA2 ist dabei essentiell für die Produktion des Attraktionssignals LPC in apoptotischen Zellen. Da die Expression von aktiver iPLA2 in vitalen Zellen jedoch nicht zu einer Freisetzung des Attraktionssignals führte, musste angenommen werden, dass weitere apoptotische Ereignisse an der Generierung und dem Export von LPC beteiligt sind. Es zeigte sich, dass die Oxidation von Membranlipiden, wie Phosphatidylcholin, durch reaktive Sauerstoffverbindungen ein zusätzlicher Faktor ist, der zur verstärkten Produktion von LPC beiträgt - vermutlich weil peroxidierte Lipide anfälliger für eine PLA2-vermittelte hydrolytische Spaltung sind als nicht-oxiderte. Weitere Untersuchungen zum genauen Exportmechanismus von LPC ergaben, dass das ABC (ATP-binding cassette transporter)-Familienmitglied ABCA1 essentiell für die Freisetzung des Attraktionssignals während der Apoptose ist. Somit konnten mit der Lipidoxidation und dem ABCA1-vermittelten LPC-Export weitere entscheidende Elemente der LPC-Produktion und anschließenden Freisetzung dieses ?find-me?-Signals während der Apoptose charakterisiert werden.
Nachdem die Generierung und Freisetzung des Attraktionssignals LPC näher aufgeklärt werden konnte, stellte sich die Frage, welche Rezeptoren die Wirkung von LPC auf den Phagozyten vermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass der G-Protein-gekoppelte Rezeptor G2A verantwortlich ist für die Migration von Monozyten auf das Attraktionssignal LPC. Die molekularen Mechanismen, die letztendlich zur LPC-stimulierten, G2A-vermittelten Migration führen, sind jedoch weitgehend unbekannt. Auch eine Beteiligung anderer Rezeptoren an der LPC-vermittelten Anlockung von Phagozyten oder das Vorhandensein weitere chemotaktisch aktiver Signale kann hier nicht ausgeschlossen werden, zumal sich in der Literatur einige Hinweise auf chemotaktisch aktive Proteine finden. Ob diese oder weitere Faktoren im Zusammenhang mit der LPC-vermittelten Chemotaxis monozytärer Zellen stehen, ist bis jetzt jedoch nicht untersucht.
Die Erkennung und Internalisierung sterbender Zellen erfolgt über die Interaktion von verschiedenen auf apoptotischen Zellen vorhandenen ?eat-me?-Signalen mit spezifischen Oberflächenrezeptoren von Phagozyten, wobei diese Interaktion direkt oder indirekt über Brückenproteine stattfindet. In diesem Zusammenhang konnte hier gezeigt werden, dass das Calcium- und Phospholipid-bindende Protein Annexin I von apoptotischen Zellen externalisiert wird, und zwar unabhängig vom verwendeten Apoptose-Stimulus, jedoch Zelltyp-abhängig. Die Bindung von Annexin I auf der Oberfläche der sterbenden Zelle erfolgt Calcium-abhängig über die Annexin-Boxen an ebenfalls externalisiertes Phosphatidylserin, das ein zentrales Phagozytose-Signal darstellt. Dadurch kann Annexin I die Eliminierung dieser Zellen durch professionelle Phagozyten stimulieren und erfüllt somit die Funktion eines Brückenmoleküls in der phagozytotischen Synapse. Über welche Rezeptoren Annexin I dabei von Phagozyten erkannt wird, ist dagegen bis jetzt nicht klar.
Insgesamt stellen die hier untersuchten Phänomene wichtige Schritte bei der effizienten Eliminierung apoptotischer Zellen dar, die dazu beiträgt, dass der apoptotische Zelltod, im Gegensatz zur Nekrose, ohne schädigende Nebenwirkungen für den Gesamtorganismus abläuft. Ist dieser komplexe, mehrstufige Prozess gestört, können nicht-eliminierte apoptotische Zellen zur Quelle für inflammatorische Reaktionen werden. In verschiedenen Tiermodellen konnte gezeigt werden, dass sowohl Defekte bei der Anlockung von Phagozyten als auch bei der Erkennung und Internalisierung durch ?eat-me?-Signale und der anschließenden Degradation der apoptotischen Zellen Ursache für die Entwicklung schwerer Autoimmunerkrankungen sein können. Auch die Entstehung des humanen systemischen Lupus erythematodes und von rheumatoider Arthritis wird inzwischen mit der unzureichenden Eliminierung apoptotischer Zellen in Zusammenhang gebracht.
The efficient elimination of apoptotic cells by neighbouring cells or professional phagocytes is essential for tissue homeostasis in multicellular organisms. Therefore, the apoptotic cell displays different so-called ?eat-me?-signals on its cell surface that are crucial for its recognition and engulfment. Especially in higher organisms, where the dying cell and the phagocyte are usually not located in immediate proximity, the release of soluble attraction signals is of special importance. Only recently, the phospholipid lysophosphatidylcholine (LPC) could be identified as a central ?find-me?-signal that is generated by the calcium-independent phospholipase A2 (iPLA2)-mediated hydrolysis of phosphatidylcholine. During apoptosis iPLA2 is processed in a caspase-3-dependent fashion. In the present thesis it could be demonstrated that iPLA2 is cleaved directly by caspase-3 and that this processing leads to its activation. The active iPLA2 is essential for the production of the phospholipid-?find-me?-signal LPC in apoptotic cells. However, the observation that overexpression of the active form of iPLA2 alone was not sufficient for the release of the attraction signal from vital cells implied that other apoptotic events might contribute to the generation and export of the ?find-me?-signal LPC. It turned out that the reactive oxygen species-driven oxidation of membrane lipids like phosphatidylcholine is an additional factor that leads to the enhanced production of LPC, probably because oxidized lipids are more susceptible for PLA2-mediated hydrolysis than non-oxidized lipids. Further studies about the detailed export mechanism of LPC revealed that the ATP-binding cassette transporter (ABC)-family member ABCA1 is essential for the release of the attraction signal during apoptosis. Thus, the oxidation of membrane lipids and the ABCA1-driven export of LPC could be identified as important elements of LPC-generation and its subsequent release during apoptosis.
After the generation and the release of the attraction signal LPC could be demonstrated in more detail the consequent question arose which receptors might mediate the effects of LPC on the phagocytes. In the present thesis it could be demonstrated that the G-protein-coupled receptor G2A is responsible for the LPC-stimulated migration of monocytic cells. However, the molecular mechanisms that ultimately lead to the LPC-driven, G2A-mediated migration, are not known so far. Accordingly, a participation of other receptors or the existence of further chemotactic signals cannot be ruled out at this point. Moreover, there are some hints for chemotactically active proteins in literature. If these or other factors contribute to the LPC-mediated chemotaxis of monocytic cells is completely unknown and needs to be clarified in future studies.
The recognition and internalization of dying cells is mediated by the interaction between different ?eat-me?-signals that are displayed on apoptotic cells, and specific surface receptors on phagocytes. In this scenario, the interaction can be of a direct nature ore rather indirect via bridging molecules. In this context, here it could be demonstrated that the calcium- and phospholipid-binding protein annexin I gets externalized by dying cells independently of the apoptotic stimulus applied, but dependent on the cell type. On the surface of the apoptotic cell, annexin I binds in a calcium-dependent fashion via its annexin-boxes to externalized phosphatidylserine, which represents a central ?eat-me?-signal. Thereby, annexin I is able to stimulate the elimination of these cells by professional phagocytes and thus fulfills the function of a bridging molecule in the phagocytic synapse. In contrast, the receptors that are responsible for the binding of annexin I to phagocytes are not known so far.
As a conclusion it can be stated that the phenomena studied in this thesis represent important steps in the process of apoptotic cell elimination. The physiological relevance of apoptotic cell clearance is the fact that apoptosis, in contrast to necrotic cell death, is highly regulated at all stages and usually turns out without any harmful consequences to the organism. If this complex, multistep process is disturbed, non-cleared apoptotic cells can become a source for inflammatory reactions. In different animal models it could be demonstrated that defects in the attraction of phagocytes as well as deficiencies in the recognition and internalization via ?eat-me?-signals and the subsequent degradation of the apoptotic prey can be a reason for the onset of severe autoimmune disorders. In this context, the development of human systemic lupus erythematosus and of chronic arthritis is discussed to be initiated by the inefficient elimination of apoptotic cells.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Lutz
Graeve
Prof. Dr.
2007-09-26
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-2128
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2007/212/
oai:opus.uni-hohenheim.de:227
2008-02-13T11:48:51Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Regulatory elements controlling the expression of OR37 genes
Regulatorische Elemente zur Kontrolle der Expression von OR37 Genen
Yongquan
Zhang
570
Gen
Regulatorische Elemente , Genexpression , OR37 , Olfaktion , transgen regulatory elements , gene expression , OR37 , olfaction , transgene
The genes of the OR37 family are clustered in two loci (cluster I and cluster II) on mouse chromosome 4. These genes encode distinct olfactory receptors (ORs) which are characterised by an insertion of six amino acids in the third extracellular loop and moreover, these receptor types are only expressed in cells which are segregated in a small patch on the central nasal turbinate. As first steps to unravel the molecular basis of this unique topographic expression pattern previous studies have led to the identification of highly conserved sequence motifs including an olf-1 site in the putative promoter region of these genes and subsequently several transcription factors were identified which did bind to these sites. However, it remained elusive if an interaction between the transcription factors and the putative promoter sites may have functional implications. Therefore, a heterologous system was employed to assess the consequence of an interaction between the putative promoters and the transcription factors. HEK 293 cells were cotransfected with a reporter gene under the control of putative mOR37 promoter regions and an expression vector based gene encoding the transcription factor. The expression rate of the reporter gene was monitored by measuring luciferase activity. It was found that the three O/E transcription factors (O/E-1, O/E-2 and O/E-4) induced significant activation of the mOR37 promoters; in addition, it was observed that the putative promoters of other OR genes were also activated, suggesting that the O/E proteins may play a general role in the regulation of OR gene expression. Mutagenesis experiments revealed that the effects of O/E proteins were dependent on the presence of an olf-1 site within the promoter region. For the transcription factor Lhx-2 it was found that not all but only promoters of distinct OR-genes were affected. For the mOR37 promoters a simultaneous action of O/E protein and Lhx-2 elicited an increase of reporter gene expression. The data indicate that the putative mOR37 promoters could drive gene expression in the presence of the crucial transcription factors in this heterologous system. In order to explore to what extent the promoter may contribute to the characteristic topographic expression pattern of the mOR37 genes in vivo, a mOR37C transgene which included the coding exon and the putative promoter, was randomly inserted into the mouse genome. Seven lines were obtained; in all lines the transgene was specifically expressed in olfactory sensory neurons (OSN). In six lines the transgene expression was restricted to the central patch of the olfactory turbinates, typical for the OR37 genes. In one line (line 7) the transgene was also expressed in OSNs ectopically positioned outside the patch within the medial zone. It was found that the transgene was expressed in a mutually exclusive manner and from only one allele. The axons of OSNs expressing the transgene co-converged in the same glomerulus with the axons from neurons expressing the endogenous gene. In line #7 the formation of ectopic glomeruli was observed. The number of OSNs expressing the transgene varied considerably among lines; these differences were independent from the copy number of the transgene. The data indicate that the short putative promoters, most likely the conserved motifs, were sufficient to drive the OR37 gene expression in a tissue specific way and most aspects of the OR37 gene expression were mimicked by the transgene; however, considerable differences between certain lines suggested additional regulatory elements, such as a locus control region (LCR). Since regulatory elements for gene transcription, such as promoters, enhancers and LCRs, appear to be conserved across species, a comparative approach was utilized to search for the LCR-like element for the OR37 locus by sequence alignment across distantly related mammals. A segment of 270 base pairs located 137 Kb upstream of OR37 cluster I was found to be highly conserved between mouse, human, dog and opossum. It was not associated with an exon of any known gene and was highly correlated with OR37 cluster I rather than with the neighboring genes, since the flanking genes did not show syntenic conservation in the opossum genome. A homologous counterpart for this segment was found downstream of the OR37 cluster II locus; an alignment of the cluster II sequence across species identified the conservation of this counterpart. Examination for relevant motifs in this segment and comparison with the conserved H element revealed two common transcription factor binding sites, at least one of them is known to be essential for generating DNase I hypersensitive sites in the LCR of the beta globin gene locus. Further studies are required to evaluate a possible role of this conserved segment in the regulation of the OR37 gene expression.
Die olfaktorischen Rezeptoren (OR) der OR37-Familie sind durch eine verlängerte dritte extrazelluläre Domäne und ihre spezifische Expression in olfaktorischen Sinneszellen (OSZ) eines kleinen Areals der zentralen Nasenturbinale charakterisiert. Die kodierenden Gene dieser distinkten OR-Familie sind an 2 Loci (Cluster I und II) auf dem Chromosom 4 der Maus lokalisiert. Im Hinblick auf ein Verständnis der molekularen Grundlagen für das einzigartige topographische Expressionsmuster dieser Gene wurden in früheren Untersuchungen hochkonservierte Sequenzmotive, inklusive eine olf-1 Bindungsstelle, in ihren putativen Promotorregionen ermittelt; darüber hinaus wurden mehrere Transkriptionsfaktoren identifiziert, die von diesen Promotor-Regionen gebunden werden. Ob Interaktionen dieser Transkriptionsfaktoren und der Promotorregion funktionelle Auswirkungen auf eine Expression der Gene haben, ist noch ungeklärt. Diese Frage wurde mit Hilfe eines heterologen Systems untersucht; dazu wurde in HEK 293-Zellen ein Reportergen unter der Kontrolle von Promotorregionen der mOR37-Gene eingeschleust und Transkriptionsfaktoren mittels spezifischer Expressionsvektoren generiert. Die Expressionsrate des Reportergens wurde durch die Ermittlung der jeweiligen Luciferaseaktivität bestimmt. Dabei zeigte sich, dass drei Transkriptionsfaktoren der O/E-Familie (O/E-1, O/E-2 und O/E-4) eine signifikante Aktivierung der mOR37 Promotoren induzierten; allerdings wurden auch putative Promotoren anderer OR-Gene aktiviert. Mutagenese-Experimente haben gezeigt, dass der Einfluss der O/E-Proteine die Anwesenheit einer intakten olf-1 Bindungsstelle der Promotorregion benötigt. Diese Befunde sprechen dafür, dass O/E-Proteinen eine generelle Bedeutung für die Regulation der OR-Expression zukommen könnte. Für den Transkriptionsfaktor Lhx-2 wurde festgestellt, dass nur Promotoren von distinkten OR-Genen beeinflusst wurden. Eine gleichzeitige Aktion von O/E- und von Lhx-2-Proteinen bewirkte eine erhöhte Expressionsrate des Reportergens. Diese Ergebnisse sprechen für eine Beteiligung der putativen Promotoren und der identifizierten Transkriptionsfaktoren an der Expressions-Kontrolle von OR37-Genen. Um herauszufinden, in welchem Maße die identifizierte putative Promotor-Region das charakteristische topographische Expressionsmuster der mOR37-Gene in vivo bestimmt, wurde ein Transgen von mOR37C, bestehend aus dem kodierenden Exon sowie dem putativen Promotor generiert und anschließend zufällig in das Mausgenom integriert, um zu prüfen, ob die putative Promotor-Region der OR37-Gene alle Informationen für die zellspezifische und topographische Expression beinhaltet oder ob die Integrationsstelle im Genom entsprechenden Einfluß ausübt. In den sieben generierten Mauslinien wurde das Transgen exklusiv in OSZ exprimiert. In 6 Linien beschränkte sich die Expression des Transgens auf die typische zentrale OR37-Region des olfaktorischen Epithels. In einer Linie (Linie 7) wurde das Transgen auch ektopisch, d.h. außerhalb der zentralen Region exprimiert. In den entsprechenden OSZ wurde ausschließlich das Transgen und nur ein Allel exprimiert (monoallelisch). Die Anzahl der transgen- exprimierenden OSZ variierte zwischen den Linien beträchtlich, wobei allerdings keine Korrelation mit der Anzahl der Transgen-Kopien bestand. Die Axone der transgen-exprimierenden OSZ projizierten in denselben Glomerulus wie die Axone von Neuronen, die das endogene Gen exprimierten. In Linie 7 wurde die Bildung von ektopischen Glomeruli beobachtet. Die Ergebnisse zeigen, dass eine relativ kurze Promoter-Region offenbar ausreicht, um die gewebespezifische und regionsspezifische Expression der OR37-Gene sicherzustellen; die beträchtlichen Unterschiede in der Zellzahl deutet jedoch auf zusätzliche Regulationselemente hin. Da Regulationselemente für die Transkription von Genen, wie Promotoren, Enhancer und Locuskontrollregionen (LCR) oft speziesübergreifend konserviert sind, wurde durch Sequenzvergleiche von weitläufig verwandten Säugetierspezies versucht, solche konservierten Sequenz-Abschnitte für die OR37-Loci zu ermitteln. Dabei wurde ein Segment von 270 Basenpaaren entdeckt, das sich 137 Kb oberhalb des OR37-Clusters I befindet und zwischen Maus, Mensch, Hund und Opossum hochkonserviert ist. Das 270 bp Segment korrelierte sehr viel stärker mit dem OR37 Cluster I als mit benachbarten Genen, da die begleitenden Gene keine syntenische Konservierung im Opossumgenom aufwiesen. In der Nähe von Cluster-II des OR37-Locus wurde ein entsprechendes Element entdeckt; ein Spezies- Vergleich des Segments für Cluster II zeigte die Konservierung dieses Elementes. Untersuchungen hinsichtlich potentiell relevanter Motive in diesem Segment und Vergleiche mit dem konservierten H element haben zu Identifizierung von zwei Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren geführt; eine davon entspricht der essentiellen hypersensitiven DNase-I Stelle in der LCR des Betaglobin-Genlocus. Zukünftige molekulargenetische Studien sollten zur Klärung der funktionellen Bedeutung dieses konservierten DNA-Segmentes für die Regulation der Expression von OR37-Genen beitragen.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Heinz
Breer
Prof. Dr.
2007-12-20
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-2272
application/pdf
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2008/227/
oai:opus.uni-hohenheim.de:223
2008-02-13T15:21:01Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Lokalisation von Pheromon-Rezeptoren und -Bindeproteinen in antennalen Sensillen von Insekten
Localisation of pheromon-receptors and -bindingproteins in antennal sensillae of insects
Thomas
Gohl
570
Biologie
Insekten , Olfaktion , Pheromone , Rezeptoren , Bindeproteine Insects , Olfaction , Pheromones , Receptors , Bindingproteins
Die bemerkenswerte Reaktivität von Motten auf spezifische Pheromone basiert auf einer extrem hohen Selektivität und Sensitivität der sensorischen Zellen in den Männchenantennen. Als Grundlage dafür wird eine Ausstattung der Zellen mit spezifischen Rezeptoren angesehen. Erst die Genom-Sequenzierung von Bombyx mori und Heliothis virescens hat eine Identifizierung von Kandidaten-Genen für olfaktorische Rezeptoren ermöglicht; dabei hat sich gezeigt, dass diese generell sehr heterogene Gruppe von Rezeptorgenen eine Subfamilie umfasst, die über Speziesgrenzen hinaus eine auffällige Sequenzhomologie aufweist. Eine konservierte Primärstruktur war für Pheromonrezeptoren postuliert worden. Im Hinblick auf eine Charakterisierung wurde im Rahmen dieser Arbeit mit verschiedenen experimentellen Ansätzen geprüft, ob diese Rezeptorkandidaten in Zellen der Pheromon-sensitiven Sensillenhaare (Sensilla trichodea) exprimiert werden. Mittels ?whole mount? in situ Hybridisierung wurde in den Antennen von Bombyx mori die RNA der Rezeptortypen BmOR1 bzw. BmOR3 in Zellen visualisiert, die unmittelbar benachbart positioniert sind und in ihrem Verteilungsmuster den trichoiden Sensillenhaaren entsprechen. Entsprechend konnte auch bei Heliothis virescens für einige Rezeptortypen dieser Gruppe (HR13, HR14, HR16) gezeigt werden, dass sie in Zellen exprimiert werden, die den Pheromon-sensitiven trichoiden Sensillenhaaren zugeordnet werden konnten. Neben den spezifischen Rezeptoren der Sinneszellen wird bei der Detektion von hydrophoben Pheromonmolekülen auch den Pheromonbindeproteinen (PBPs) eine wichtige Funktion zugeschrieben; PBPs werden in Glia-ähnlichen Zellen produziert, welche die Sinneszellen umgeben. In Doppel- in situ Hybridisierungsexperimenten konnte gezeigt werden, dass z.B. die HR13-Zellen in der Tat von HvirPBP1- und HvirPBP2-exprimierenden Zellen umgeben sind. Vergleichende Untersuchungen zur Topologie verschiedener Rezeptortypen haben gezeigt, dass HR13-Zellen dem trichoiden Sensillen-Typ A zuzuordnen sind, während HR14 und HR16 in Zellen des Sensillen-Typs C exprimiert werden. Diese charakteristischen topologischen Expressions-muster sind als weiterer Hinweis zu werten, dass es sich bei den Rezeptorkandidaten tatsächlich um Rezeptoren für Pheromone handeln dürfte. Die Zuordnung individueller Rezeptortypen zu distinkten Sensillen-Typen eröffnet neue Ansätze für die Ermittlung der funktionellen Implikationen von Rezeptortypen für die Registrierung von Haupt- und Nebenkomponenten komplexer Pheromon-Gemische. Im Verlauf einer weiteren Charakterisierung von Rezeptor-exprimierenden Zellen hat sich gezeigt, dass nur der Rezeptortyp HR13 eine Coexpression mit einem ?Markerprotein? für sensorische Neurone, dem SNMP1 (Sensory Neuron Membrane Protein 1) aufwies, nicht jedoch die beiden Rezeptortypen HR14 und HR16. Zur Überprüfung der These ob u. U. ein weiterer SNMP-Subtyp existiert, wurden Screeningverfahren durchgeführt und dabei tatsächlich ein neuer SNMP-Typ (SNMP2) von Heliothis virescens identifiziert. Untersuchungen zur Expression haben gezeigt, dass die topologische Verteilung der SNMP2-Zellen zwar mit der von SNMP1-Zellen vergleichbar ist, dass sie jedoch eine sehr unterschiedliche Morphologie aufweisen. Weiterführende Untersuchungen haben dann gezeigt, dass SNMP2 in den PBP-produzierenden Hüllzellen der trichoiden Sensillenhaare exprimiert wird. Diese Befunde stellen die SNMP-Proteine in einen neuen Kontext und eröffnen neue Spekulationen über deren mögliche Funktionen.
Ein wichtiges Ziel dieser Arbeit war der Versuch, die Rezeptor-relevanten Zellen nicht nur mittels mRNA-Visualisierung zu identifizieren, sondern die eigentlichen Rezeptorproteine immunhistochemisch zu erfassen. Obwohl sich die Generierung von Antikörpern für olfaktorische Rezeptoren als extrem schwierig erwiesen hat, ist es gelungen, für den Rezeptortyp HR13-spezifische Antikörper zu gewinnen. Mit Hilfe dieser Antikörper war es dann erstmals möglich, immunhistochemische Untersuchungen zur Lokalisation des Rezeptorproteins HR13 durchzuführen. In Doppelmarkierungsstudien mit einer HR13 antisense RNA-Sonde und den HR13-spezifischen Antikörpern konnte die Colokalisation von mRNA und Protein in den entsprechenden Zellen nachgewiesen werden. Darüber hinaus war es mit konfokaler Laserscanningmikroskopie möglich, die Verteilung des Rezeptorproteins in den verschiedenen Kompartimenten, insbesondere auch in den sensorischen Dendriten, zu visualisieren. Außerdem hat sich gezeigt, dass Rezeptorproteine auch in den axonalen Fortsätzen der sensorischen Zellen vorkommen. Durch Rezeptor-spezifische Markierungen wurde deutlich, dass die Axone mit HR13-Rezeptoren im antennalen Nerv als Bündel organisiert sind. Im Antennen-Nerv konnten HR13-markierte Axone bis zum Eintritt in die ?sorting zone? des antennalen Lobus visualisiert werden; im Unterschied zu den Befunden bei der Maus, war eine Markierung in den entsprechenden Glomeruli nicht nachweisbar.
The remarkable reactivity of moth to specific pheromones is based on the extreme selectivity and sensitivity of sensory cells in the male antennae. This feature is supposed to be based on cells equipped with specific receptors. Only the sequencing of the genomes of Bombyx mori and Heliothis virescens provided the possibility to identify candidate genes of olfactory receptors in moths. Upon detailed inspection of candidate receptors it turned out that within the generally very heterogeneous group of receptor-genes a subfamily exists containing members of both species showing striking sequence homology. A conservation of the primary structure of receptors for pheromones has been postulated. For a continuing characterization in these studies different approaches were used to verify that these receptors are indeed expressed in cells of pheromone-sensitive sensilla (sensilla trichodea). By means of ?whole mount? in situ hybridization experiments the RNA of the receptor types BmOR1 and BmOR3 could be visualized in directly neighboring cells reflecting the topology of trichoid sensilla. Also some of the Heliothis receptor types (HR13, HR14, HR16) could be assigned to sensilla trichodea. In addition to the specific receptors, the pheromone binding proteins (PBPs) are expected to play an important role in the detection of hydrophobic pheromone molecules. PBPs are produced by glia-like cells surrounding the sensory neurons. In double in situ hybridization experiments it could be shown that HR13-cells are indeed surrounded by cells expressing HvirPBP1 and HvirPBP2. Analysis comparing the topology of different receptor-types showed that cells expressing HR13 can be assigned to sensilla trichodea type A, whereas HR14 and HR16 are expressed in cells of sensilla trichodea type C. This characteristic expression pattern is considered as a further indication that these candidate-receptors are indeed pheromone-receptors. The assignment of individual receptor-types to distinct sensilla-types provides the basis for investigating the functional implications of receptor-types for the registration of main or minor components of complex pheromone-blends. Further it turned out that HR13 shows coexpression with SNMP1 (sensory neuron membrane protein 1) which is considered as a ?marker?-protein for antennal sensory neurons. This is however not the case for receptor types HR14 and HR16. In search of further SNMP-types screening-experiments were carried out which led to the identification of a novel SNMP-type (SNMP2) of Heliothis virescens. Subsequent studies concerning the expression of SNMP2 showed that the topologic distribution of SNMP2-cells is comparable to SNMP1-cells, but they show a different morphology. Further experiments revealed that SNMP2 is in fact expressed in PBP-producing cells. These findings imply that the proposed putative function of SNMPs has to be reconsidered. One major goal of this study was the attempt, to identify receptor-relevant cells by visualization of mRNA via in situ hybridization but to visualize the localization of the receptor-protein via immunohistochemical approaches. Although the generation of antibodies for olfactory receptors is very difficult, it was possible to raise antibodies specific for receptor type HR13. Using these antibodies in immunohistochemical approaches allowed to also visualize HR13-receptor-protein. By means of double-staining experiments using HR13-specific antisense RNA-probes and anti-HR13 antibodies mRNA and protein were visualized in the same specific cells. Using confocal laserscanning microscopy, it was possible to document that receptor-protein was indeed located in the sensory dendrites. Further, the receptor-protein was also visualized in the axonal processes of sensory cells and the receptor-specific staining revealed that within the antennal nerve HR13-axons appear to be organized in fascicles. These HR13-immunolabeled fascicles were visible until they reach the ?sorting zone? of the antennal lobe; in contrast to mouse olfactory bulb, no receptor specific staining was visible in the antennal lobe.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Heinz
Breer
Prof. Dr. rer. nat.
2007-11-09
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-2237
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2008/223/
oai:opus.uni-hohenheim.de:271
2008-05-26T11:33:22Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Rolle der GPCR-Signaltransduktion bei der Peptidhormonsekretion in neuroendokrinen Zellen im Darm und im Pankreas
Role of GPCR signaling in peptide hormone release in neuroendocrine cells in the gut and the pancreas
Stefanie
Leicht
570
Glucagon-related-peptides , L-Zelle , Endokrin wirksamer Stoff , Insulin , Bauchspeicheldrüse , Signaltransduktion
G-Protein gekoppelte Rezeptoren , Glucagon-like peptide 1 Glucagon-like peptide 1 , G-protein coupled receptor
Dem insulinotropen Peptidhormon Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) kommt als potentielles Therapeutikum bei der Therapie des Typ 2 Diabetes eine wesentliche Rolle zu. Während die molekularen Mechanismen der Wirkung von GLP-1 an der β-Zelle der Langerhansschen Inseln des Pankreas untersucht und aufgeklärt sind, ist bis zum heutigen Tag über die Mechanismen, die bei der GLP-1 Sekretion aus den L-Zellen im Darm eine Rolle spielen, sehr wenig bekannt. Jedoch scheint die Regulation der GLP-1 Sekretion aus den L-Zellen der Regulation der Insulinsekretion aus den β-Zellen ähnlich zu sein, wobei in der β-Zelle eine Reihe von G-Protein gekoppelten Rezeptoren die Insulinsekretion und weitere Signaltransduktionskaskaden beeinflussen. Aufgrund der Tatsache, dass die drei G-Protein gekoppelten Rezeptoren GPR40, GPR119 und GPR120 sowohl in den β-Zellen der Langerhansschen Inseln im Pankreas wie auch in den L-Zellen des Darms exprimiert werden, beschäftigte sich die vorliegende Arbeit mit der Bedeutung der drei Rezeptoren sowie ihren intrazellulären Signalwegen in der L-Zelle und der β-Zelle.
GPR40, GPR120 und GPR119 sind in den enteroendokrinen L-Zellen im Rattenileum und ?kolon zwischen den Enterozyten mit GLP-1 colokalisiert. Darüber hinaus ist GPR119 in den pankreatischen β-Zellen mit Insulin colokalisiert. GPR40 und GPR120 sind Gαq-gekoppelte Rezeptoren, Liganden sind langkettige ungesättigte Fettsäuren. GPR119 ist ein Gαs-gekoppelter Rezeptor, der durch die Bindung von Lipiden wie Oleylethanolamid aktiviert werden kann. Die Aktvierung dieser drei Rezeptoren durch selektive und unselektive Agonisten stimulierte die GLP-1 Sekretion und die glukoseinduzierte Insulinsekretion in vitro und ex vivo, wobei GPR119 die Gαq-induzierte GLP-1 Freisetzung verstärkte. Synthetische Rezeptoragonisten waren in der Lage, die fettsäureinduzierte GLP-1 Sekretion additiv zu erhöhen. Stimuliert werden konnte die GLP-1 Sekretion außerdem durch Glukose.
In L-Zellen und β- Zellen wurde in vitro gezeigt, dass GPR40, GPR119 und GPR120 über verschiedene Signalwege die Zellproliferation stimulieren und die Zellapoptose inhibieren.
In der vorliegenden Arbeit wurde somit ein wesentlicher Beitrag zum Verständnis der Bedeutung von GPR40, GPR119 und GPR120 und deren Signaltransduktionswege für die Funktion der L-Zelle und α-Zelle geleistet.
The insulinotropic peptide hormone Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) led to intense interest in the use of this peptide for the treatment of patients with type 2 diabetes. The molecular mechanisms of GLP-1 in the β-cells are examined and well understood, whereas the mechanisms leading to GLP-1 secretion in the L-cells are not understood in detail. However the regulation of GLP-1 secretion from intestinal L-cells seems to be similar to the regulation of the insulin secretion in pancreatic β-cells. In the β-cells a number of G-protein coupled receptors influence the insulin secretion and other signal transduction cascades. Due to the fact, that the three G-protein coupled receptors GPR40, GPR119 and GPR120 are expressed in pancreatic β-cells as well as in the intestinal L-cells, the present studies concentrated on the expression and importance of the three receptors and on their intracellular effects in the L-cells and in the β-cells.
GPR40, GPR119 and GPR120 are colocalized with GLP-1 in the enteroendocrine L-cells in the rat ileum and colon between the enterocytes. Moreover GPR119 is colocalized with insulin in the pancreatic β-cells. GPR40 and GPR120 are Gαq-coupled receptors, ligands are longchain unsaturated free fatty acids. GPR119 is a Gαs-coupled receptor being activated by lipids like oleylethanolamide. Activation of the three receptors by selective and unselective agonists stimulates GLP-1 secretion and the glucose induced insulin secretion in vitro and ex vivo, whereas GPR119 amplifies the Gαq-induced GLP-1 secretion. Synthetic agonists were able to enhance the fatty acid induced GLP-1 secretion in an additive manner. Glucose also stimulated the GLP-1 secretion in vitro and ex vivo.
In L-cells and β-cells it has been shown that GPR40, GPR119 and GPR120 stimulate cell proliferation and inhibit cell apoptosis via different signal transduction pathways in vitro.
Hence the present studies make a contribution to the understanding of the importance of GPR40, GPR119 and GPR120 and their signal transduction pathways for the function of the L-cell and the β-cell.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Lutz
Graeve
Prof. Dr. rer. nat.
2008-04-25
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-2715
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2008/271/
oai:opus.uni-hohenheim.de:270
2008-05-27T12:00:06Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Der Beitrag von Neurofascin zur Entstehung und Lokalisation von Gephyrinclustern während der inhibitorischen Synaptogenese im ZNS
Role of neurofascin in gephyrin cluster formation and localization during inhibitory synaptogenesis in the central nervous system
Nadine
Burkarth
570
GABAerge Nervenzelle , Nervenzelle , Neurales Zell-Adhäsionsmolekül , Gephyrin , NFASC-Protein , Hippocampus
Inhibitorische synapse , Axoninitialsegment, Axonhügel Neurofascin , Gephyrin , hippocampal neuron , axon hillock , axon initial segment , inhibitory synapse
Membrangebundene Zelladhäsionsmoleküle (CAMs) stellen Schlüsselkomponenten bei der Entstehung exzitatorischer Synapsen im ZNS dar. Bislang war wenig zu deren Rolle bei der Entstehung inhibitorischer Synapsen bekannt. Insbesondere der funktionelle Zusammenhang zwischen CAMs und der Clusterbildung des postsynaptischen Gerüstproteins Gephyrin, das die Akkumulation von GABAA-Rezeptoren an inhibitorischen Postsynapsen steuert, muss noch aufgeklärt werden. Neurofascin gehört zur L1-Unterfamilie der Immunglobulin-ähnlichen CAMs (IgCAMs). In vivo wurde gezeigt, dass es die Entstehung und Lokalisation von GABAergem Input an zerebellären Purkinje-Neuronen reguliert. Neurofascin stellt deshalb ein aussichtsvolles Kandidatenmolekül für die Rekrutierung von Gephyrin an inhibitorische Postsynapsen dar.
Zu frühen Entwicklungszeitpunkten korrelierten die Bildung von Gephyrinclustern und ihre Translokation an den Axonhügel mit der Expression von Neurofascin auf dem Soma und Axoninitialsegment (AIS) dissoziierter hippokampaler Neurone. Des Weiteren wurde zu frühen Zeitpunkten der Synaptogenese hauptsächlich eine Neurofascin-Isoform exprimiert, der die fünfte Fibronektin-III ähnliche Domäne fehlt (NF-5te FN-III). Im Gegensatz dazu wurde die Isoform NF+5te FN-III erst im adulten Rattengehirn exprimiert.
Die Transfektion von Expressionsvektoren unterschiedlicher Neurofascin-Isoformen bzw. Deletionsmutanten ergab, dass die embyronale Isoform NF-5te FN-III notwendig für die Gephyrinclusterbildung ist. Dieser Prozess scheint von extrazellulären Interaktionspartnern auf prä;- bzw. postsynaptischen Komponenten abhängig zu sein. Gegenwärtig ist die Identität eines Neurofascin-Interaktionspartners jedoch unbekannt. Punktmutationen in der zytoplasmatischen Domäne Neurofascins deuten darauf hin, dass dieses durch Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden die Clusterbildung von Gephyrin induziert.
Mittels shRNA-vermitteltem Knockdown wurde gezeigt, dass Neurofascin notwendig für die Translokation von Gephyrin an den Axonhügel hippokampaler Neurone ist. Überdies ist Neurofascin sogar hinreichend für die funktionelle Wiederherstellung anomal lokalisierter Gephyrincluster nach Neurofascin-Knockdown. Die Expression von NF-5te FN-III resultierte in einer Akkumulation exogen exprimierten GFP-Gephyrins. Dies deutet auf einen funktionellen Zusammenhang zwischen Neurofascin und Gephyrin hin. Kolokalisationsstudien in HEK293- bzw. PC12E2-Zellen lieferten jedoch keinen Hinweis für eine direkte Neurofascin-Gephyrin-Interaktion, die zu den beobachteten Effekten führt.
Membrane-bound cell adhesion molecules (CAMs) were discovered to be key players in initiating excitatory synapse formation in the CNS. However, so far little is known about the role of CAMs in inhibitory synapse development. In particular, a functional link between CAMs and the clustering of postsynaptic scaffold component gephyrin, which is a critical determinant of y-aminobutyric acid A (GABAA) clustering, still needs to be elaborated. Neurofascin belongs to the L1-subgroup of the immunoglobuline like CAMs (IgCAMs). In vivo Neurofascin has been shown to direct the formation and localization of GABAergic Input on cerebellar Purkinje neurons. Thus it serves as a candidate molecule recruiting gephyrin to inhibitory postsynaptic sites.
At early stages of inhibitory synaptogenesis, formation of gephyrin clusters and their translocation to the axon hillock correlated with a somatic expression of neurofascin in rat hippocampal neurons. Furthermore, a neurofascin splice variant lacking the extracellular fifth fibronectine-III like domain (NF-5te FN-III) was predominantely expressed at early stages of synapse formation. In contrast expression of NF+5te FN-III harbouring the fifth fibronectine-III like domain was prominent only in adult brain.
Transfection of expression vectors for different splice variants and deletion mutants of neurofascin revealed that the embryonic neurofascin isoform NF-5te FN-III is required for the formation of gephyrin clusters. This process is presumably dependent on extracellular interactions with molecules on pre- and postsynaptic terminals, respectively. However, possible interaction partners for neurofascin are unknown. Point mutations in the cytoplasmatic domain of neurofascin inhibited the formation of gephyrin clusters suggesting intracellular signal transduction pathways triggered by neurofascin.
Furthermore, expression of neurofascin is necessary for the translocation of gephyrin clusters to the axon hillock of hippocampal neurons as shown by shRNA-mediated knockdown. In addition, overexpression of an embryonic neurofascin isoform was sufficient for functional rescue after knockdown of endogenous neurofascin. Expression of NF-5te FN-III resulted in the accumulation of exogenous GFP-Gephyrin at the axon initial segment AIS suggesting a functional link between neurofascin and gephyrin. However, colocalization studies in HEK293 and PC12E2 cells, respectively, did not provide an indication of direct neurofascin gephyrin interactions leading to the observed effects.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Hansjürgen
Volkmer
Dr.
2008-04-24
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-2702
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2008/270/
oai:opus.uni-hohenheim.de:312
2008-12-02T09:11:58Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Posttranslationale Modifikationen der IL-6-Typ-Zytokin-Rezeptoren gp130 und LIFR und ihr Einfluss auf die Assoziation mit Detergenz-resistenten Membranmikrodomänen (DRM)
Posttranslational modifications of IL-6-Typ-cytokine receptors gp130 and LIFR and their influence on the association with detergent-resistant membranes (DRMs)
Inna
Ziegler
570
Cytokine , Cholesterin , Plasmamembran , Biomembran , Membran , Rezeptor-Tyrosinkinasen , STAT , P-STAT , Leukaemia-inhibitory factor
gp 130, lipid rafts, Detergenz-resistente Membranmikrodomänen , posttranslationale Modifikationen lipid rafts
Posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierung oder Palmitoylierung, aber auch Wechselwirkungen mit anderen Proteinen können die Lokalisation von Rezeptoren innerhalb von Detergenz-unlöslichen Membrandomänen/ lipid rafts und somit die Signaltransduktion beeinflussen. In dieser Arbeit wurden die posttranslationalen Modifikationen von LIFR und gp130 und ihr Einfluss auf die Assoziation mit Detergenz-resistenten Membranmikrodomänen untersucht.
Palmitoylierung von Cysteinresten innerhalb der Transmembrandomäne eines Proteins kann die DRM-Assoziation beeinflussen. Da gp130 zwei Cysteinreste in der Transmembrandomäne enthält, wurde die Rolle dieser Cysteine für die DRM-Assoziation untersucht. Aus den Befunden kann zusammengefasst werden, dass die Cysteine C711 und C725 in der Transmembrandomäne von gp130 keinen signifikanten Einfluss auf die DRM-Assoziation haben. Nach der Isolierung der DRM mit Brij 58 und Triton X-100 wurde entgegen der Erwartungen sogar eine leichte Steigerung der DRM-Assoziation der C->A-Mutanten beobachtet.
Für LIFR konnte nach DRM-Isolierung mit Brij 58 und Triton X-100 eine partielle Assoziation mit den Detergenz-unlöslichen Membrandomänen bestätigt werden. Weiterhin wurden zwei unterschiedliche N-Glykosylierungsformen des Rezeptors nachgewiesen. Die Mannose-reiche (Vorläufer) Form tritt bevorzugt in der Detergenz-löslichen Fraktion auf und wird von dem Enzym Endo-Glykosidase Hf degradiert. Die hybride (reife) Form neigt zur stärkeren Assoziation mit den Detergenz-unlöslichen Mikrodomänen. Nur die reife LIFR-Form wird nach der Bindung von LIF an den Rezeptorkomplex in 3T3-L1- und HepG2-Zellen phosphoryliert, was in Verbindung mit anderen Ergebnissen unserer Arbeitsgruppe darauf hindeutet, dass nur die reife Form an der Zelloberfläche exprimiert wird und an der Signaltransduktion beteiligt ist.
In HepG2-Zellen wurde nach Stimulation mit LIF eine Erhöhung der LIFR-Phosphorylierung in Detergenz-unlöslichen Membranmikrodomänen (DRM) nachgewiesen. Phosphoryliertes gp130 wurde nach LIF-Gabe hingegen hauptsächlich in der nicht-DRM-Fraktion detektiert. Die Widersprüchlichkeit dieses Ergebnisses kann auf methodische Probleme zurückgeführt werden. Außerdem wurde in 3T3-L1-Zellen eine stärkere Phosphorylierung des LIFR in der DRM-Fraktion nicht bestätigt. In 3T3-L1 findet die Aktivierung von gp130 und LIFR in der gleichen Plasmamembrandomäne (nicht-DRM) statt. Das deutet einerseits auf zelluläre Unterschiede bezüglich Rezeptoraktivierung und Verteilung innerhalb der Plasmamembran, und andererseits auf unterschiedliche Sensitivität der lipid rafts gegenüber den verwendeten Detergenzien hin.
Post-translational modification of proteins is an important event in the regulation of cellular functions. Glycosylation or palmitoylation, but also ligand binding can affect the localization of proteins in membrane microdomains and thus affect signal transduction. The aim of this study was to analyze how posttranslational modifications of LIFR and the common signal transducer gp130 impact the translocation to detergent resistant membranes (DRMs, lipid rafts).
Palmitoylation of cysteine residues within the transmembrane domain of a protein is considered to be one process that assists in the localization of proteins to DRMs. Gp130 has two cysteine residues C711 and C725 in its transmembrane domain. My studies indicate that these cysteine residues have no significant influence on lipid raft association of gp130. Contrary to our expectations, after isolation of DRMs with Brij 58 and Triton X-100 an increase of raft association of the C->A-mutants was detected.
Partial DRM association of LIFR was confirmed by using Brij 58 and Triton X-100 protocols. Furthermore, two different N-glycosylation types of that receptor could be detected. The mannose-rich (precursor) species is preferentially found in non-DRMs and is degraded by Endo-Glycosidase Hf. The hybrid-type (mature) tends towards an association with DRMs. My results indicate that only the mature-type of LIFR was phosphorylated after LIF binding to the receptor complex in 3T3-L1 and HepG2 cells. Combined with other data from our workgroup these findings suggest that only the mature-type of LIFR is expressed at the plasma membrane surface and involved in signal transduction.
After stimulation with LIF an increase of LIFR tyrosine phosphorylation was observed in DRMs in HepG2 cells. However, phosphorylation of gp130 was detected only in non-DRMs fractions after stimulation with LIF. The inconsistency of these results can be explained with methodical problems. Furthermore, the translocation of phosphorylated receptors described above could not confirmed in 3T3-L1 cells. In this cell line, the activation of gp130 and LIFR occurs in detergent-resistant membranes. These findings indicate differences between cell lines with respect to receptor activation and translocation within the plasma membrane on the one hand and demonstrate a differential sensitivity of raft subdomains to extraction by different detergents on the other hand.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Lutz
Graeve
Prof. Dr.
2008-10-10
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-3124
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2008/312/
oai:opus.uni-hohenheim.de:313
2008-12-03T07:55:42Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Neuronale Modulation : der Einfluss von Agonisten und inverser Agonisten auf das Cannabinoidsystem einer hippocampalen Primärkultur
Neuronal modulation: The effect of agonists and inverse agonists on the cannabinoid system of a hippocampal primary cell culture
Oliver
Klink
570
Endocannabinoide , Zellkultur , Agonist
Cannabinoidsystem , inverse Agonisten , neuronale Modulation primary cell culture , inverse agonists , neuronal modulation
Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkung von inversen Agonisten des CB1-Rezeptors anhand einer primären hippocampalen Neuronen-/Gliazellen- Kokultur zu untersuchen. Immuncytochemisch konnte gezeigt werden, dass in den kultivierten Neuronen die CB1-Rezeptoren in nachweisbaren Mengen exprimiert werden. Die aus Rattenembryonen erstellte Primärkultur wurde weiterhin auf elektrophysiologische Parameter untersucht um eine in vivo nahe in vitro Kultur zu gewährleisten. So reagieren die Neuronen auf TTX mit verminderter Spikeaktivität die auf die Blockierung der spannungsabhängigen Natriumkanäle zurückzuführen ist. Auch die Inhibition von AMPA Rezeptoren unter Verwendung von CNQX zeigte eine Reduktion der Spikefrequenz auf synaptischer Ebene. Analysen der Kinetik und der Frequenz der generierten Aktionspotentiale, sowie der AMPA- und NMDA EPSCs sind mit bereits publizierten in vitro und in vivo Daten weitgehend vergleichbar. Um die intrinsische Variabilität des verwendeten Assays zu verringern, wurde der für die pharmakologischen Untersuchungen des Cannabinoidsystems eingesetzte Messpuffer mit einer geringen Konzentration Magnesium versehen, um den NMDA-Rezeptorblock aufzuheben. Die daraus resultierenden Aktionspotential-Bursts sorgten einerseits für eine geringere Variabilität der Messungen, andererseits konnte durch erweiterte Analysen dieser Bursts die Auswirkungen der eingesetzten CB1-Agonisten und inversen CB1-Agonisten auf das Burstverhalten der gemessenen Neuronen ermittelt werden. Hierbei zeigte sich ein gegensätzliches Verhalten von Aktionspotentialfrequenz zur Modulation der generierten Aktionspotentiale pro Burst, Pausen zwischen den Bursts und Länge der Bursts. Auf der Basis der durch die Aktionspotential-Frequenzanalysen gewonnenen Daten konnte erstmals eine agonistische Komponente bei nanomolaren Dosen der inversen Agonisten gezeigt werden, was auf eine spezifische Interaktion mit einem beteiligten oder noch nicht bekannten Rezeptor hindeutet. Die Blockierung der Adenylatzyklase, eines Schlüsselenzyms in der Signaltransduktion des CB1-Rezeptors, hebt diesen Effekt auf, allerdings ist auch kein invers agonistischer Effekt mehr messbar. Des weiteren wurde auf eine Beteiligung des Opioidsystems an der agonistischen Wirkung des inversen Agonisten Rimonabant untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte keine der publizierten Wechselwirkungen dieser beiden Systeme im Bezug auf den agonistischen Effekt von Rimonabant beobachtet werden.
The aim of this thesis was to investigate the effect of inverse agonists on the CB1-receptor with an established complex neuronal-/ glia- co culture obtained from hippocampi of embryonic rats. To provide evidence of the expression of the CB1-receptors in the established culture immunocytochemical studies have been used and showed a sufficient expression level of the CB1-receptors. The neuronal culture was further tested on various electrophysiological parameters to verify an in vitro assay that resembles in vivo characteristics. Thus the exposure of TTX to neurons lead to reduced spike activity which refers to the blocking of voltage gated sodium channels. Also the inhibition of AMPA receptors using CNQX showed a reduction of spike activity in respect of the reduced synaptic activity. Analyses of the kinetic and spike frequencies of the generated actionpotentials as well as the kinetics and frequencies of spontaneous AMPA- and NMDA epscs are to a large extent comparable to published data of in vitro and in vivo assays. To reduce the intrinsic variability of the established cannabinoid assay the method of induced burst activity under low magnesium conditions has been used. This method results indeed in a lower variability of the assay but also the analysis of the effect of cannabinoid agonists and inverse agonists on the evoked burst activity showed interesting inverse modulations of burst durations, event intervals and inter-event intervals compared to alterations of the spike frequencies. On the basis of the obtained data by the analyzed spike-frequencies an agonistic effect of nanomolar concentrations of the investigated inverse agonists could be shown for the first time. This observation could lead to the conclusion that this might be a specific interaction of the investigated inverse agonist with an other receptor. The inhibition of the adenylatcyclase, a key-enzyme of the CB1 signal transduction, neutralizes the agonistic effect, although the inverse agonistic effect dissapeard. In addition the interaction of the opioid system in respect to the observed agonistic effect of rimonabant has been investigated. However, non of the published interaction of this two systems in respect to the agonistic effect of rimonabant could be observed.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Wolfgang
Hanke
Prof. Dr.
2007-11-13
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-3137
unknown
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2008/313/
oai:opus.uni-hohenheim.de:326
2009-01-14T13:39:41Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Funktionelle Untersuchung der Sensorkinase KdpD von Escherichia coli mit Hilfe verschiedener KdpD-Deletionsmutanten
Functional analysis of the sensor kinase KdpD of Escherichia coli with KdpD deletion mutants
Marina
Rothenbücher
570
Escherichia coli
Sensorkinase , KdpD , Deletionsmutanten Sensor Kinase , KdpD , Deletion Mutants
Das hochaffine K+-Transportsystem KdpFABC ist eines der Aufnahmesysteme, das in Escherichia coli K+ akkumuliert. Die Expression des kdpFABC Operons steht unter der Kontrolle der regulatorischen Proteine KdpD und KdpE, die ein typisches Sensorkinase/Antwortregulator-System darstellen. KdpD ist ein integrales Protein in der cytoplasmatischen Membran. Der N-terminalen cytoplasmatischen Domäne und den transmembranen Helices von KdpD wurden bisher die Funktion des Signal-?inputs? zugeschrieben. Überraschend war daher der Befund, dass eine Komplettdeletion der N-terminalen Domäne und der ersten beiden Helices (KdpD-C) ein voll funktionsfähigen Sensor darstellt, der auf Änderungen der K+-Konzentration im Medium reagiert. Es wurden sodann weitere Teile von KdpD-C deletiert, um den Bereich in KdpD genau zu definieren, der für die Signaltransduktion verantwortlich ist. Die Untersuchungen dieser Arbeit haben gezeigt, dass das KdpD-Konstrukt C499-894, das nur noch aus der cytoplasmatischen, löslichen Domäne besteht, in der Lage ist eine Erhöhung der K+-Konzentration im Medium zu registrieren und mit einer Reduzierung der Aktivität reagiert. Der minimale Sensor differenziert zwischen Li+, Rb+ und K+ Ionen, ebenso wie der Wildtyp. Ein Plasmid, das für den minimalen Sensor codiert, erlaubt einem kdpD-Deletionsstamm das Wachstum unter Kalium limitierten Bedingungen im Medien.
Vermutlich ist das Signal, das von KdpD wahrgenommen wird, im Periplasma. Aber wie wird das Signal zu der cytoplasmatische C-terminalen Domäne, die bei der Regulierung der Aktivität involviert ist, übertragen? Eventuell ist KdpD ist nicht der direkte Sensor und bekommt die Änderungen in der K+-Konzentration von einem weiteren Protein in der Membran übermittelt. Weitere Untersuchungen zur Membranlokalisation mit der Natrium-Carbonat-Methode haben gezeigt, dass C499-894 hauptsächlich im Überstand, dass heißt in der löslichen Form vorkommt. Dies schließt nicht aus, dass C499-894 sich nicht an die Membran anlagert und so eventuell mit einem unbekannten Protein interagiert. Bei der Suche nach diesem unbekannten Protein wurden zwei eventuelle Kandidaten ermittelt, die Cytochromoxidase A (CyoA) und die Glucosamin-6-phosphat-Synthase (GlmS). Ob diese Proteine wirklich mit KdpD interagieren muss noch nachgewiesen werden.
The high affinity K+ transport system KdpFABC is one of several uptake systems that accumulate K+ in Escherichia coli. Expression of the kdpFABC operon is under control of the regulatory proteins KdpD and KdpE, which constitute a typical sensor kinase/response regulator system. KdpD is an integral protein of the cytoplasmic membrane. The N-terminal domain, the 4 helices and 200 amino acids of the cytoplasmic C-terminal domain are accredited to be involved in the signal input function. Surprisingly, a mutant (KdpD-C) lacking the N-terminal domain, helix 1 and 2 is a functional K+ sensor, which is able to detect the changes in K+ concentration in the medium. To investigate which parts of the KdpD protein are essential for signal transduction, various truncated KdpD variants were constructed and analyzed. The results show that the fragment C499-894, which contains only the cytoplasmic C-terminal domain of KdpD, is able to recognise the increase in K+ concentration in medium and reduce the level of activity. This mini sensor is also able to discriminate between Li+, Rb+ and K+ ions like the wild-type KdpD. A plasmid coding for this mini sensor allows a kdpD deletion strain to grow under K+-limited conditions in medium.
Presumably, the signal perceived by KdpD is in the periplasm, but how is the signal transmitted to the cytoplasmic domain of KdpD that controls activity? Perhaps KdpD is not the direct sensor, an additional component in the membrane might sense the signal and communicate with KdpD. Further research with sodium carbonate extraction to determine the membrane localisation of C499-894 showed the protein mainly found in the supernatant, suggesting C499-894 is a soluble protein, although C499-894 could be attached to the membrane to come in contact with an unknown membrane protein. Looking for the unknown component two protein candidates were found by co-purification, the cytochrome oxidase A (CyoA) and the glucosamine-6-phosphate synthase (GlmS). To find an interaction between these proteins and KdpD more research has to be done.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Andreas
Kuhn
2007-12-20
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-3261
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2009/326/
oai:opus.uni-hohenheim.de:320
2009-01-15T11:04:20Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Odorantrezeptoren in Axonen olfaktorischer Sinneszellen : in vitro Studien an Explantatkulturen
Odorant receptors in axons of olfactory sensory neurons : in vitro studies in explant cultures
Georg
Luxenhofer
570
Axon , In-vitro-Kultur , Geruch
Wegfindung , Geruchsrezeptoren , olfaktorische Sinnesneurone axon guidance , in vitro culture , olfaction , sensory neurons , odorant receptors
Olfaktorische Sinnesneurone (OSN), die mit einem bestimmten Odorantrezeptor (OR) ausgestattet sind, liegen weit verstreut im olfaktorischen Epithel (OE) der Nase und senden ihr Axon in gemeinsame Glomeruli im olfaktorischen Bulb (OB). In einem räumlich hochkonservierten Muster werden dort rezeptorspezifisch synaptische Kontakte mit nachgeschalteten Projektions- und Interneuronen hergestellt. Über die molekularen Mechanismen, die dieser höchstpräzisen Verdrahtung zugrunde liegen ist trotz intensiver Forschung noch immer wenig bekannt. Im Hinblick auf eine Aufklärung der komplexen Prozesse ist ein geeignetes experimentelles System erforderlich, das eine gezielte Manipulation der auswachsenden Axone ermöglicht. In der hier vorliegenden Arbeit wurde daher zunächst ein in vitro System mit Gewebeexplantaten des olfaktorischen Systems etabliert. Die Verwendung transgener Mauslinien, in denen spezifische Sinneszellpopulationen inklusive aller zellulären Ausläufer durch intrinsische Fluoreszenz visualisierbar sind, erlaubte eine kontinuierliche Beobachtung distinkter Axonpopulationen unter definierten und manipulierbaren Bedingungen. Zellen in Explantaten des OE, die zum Zeitpunkt des Embryonalstadiums 14 (E14) in Kultur gebracht wurden, entwickelten nach wenigen Tagen zahlreiche axonale Ausläufer, die radiär und unfaszikuliert aus den Explantaten auswuchsen. Die Explantate enthielten nach kurzer Kultivierung hauptsächlich Vorläuferzellen von olfaktorischen Sinneszellen; nach einigen Tagen konnten bereits zahlreiche reife Sinneszellen mit robustem Axonwachstum nachgewiesen werden. Durch den Einsatz einer rezeptorspezifischen transgenen Mauslinie konnte weiterhin die Expression distinkter OR Gene in Subpopulationen von Sinneszellen sichtbar gemacht werden. Die Kulturbedingungen erlaubten also die Differenzierung von Vorläuferzellen zu typischen olfaktorischen Sinnesneuronen mit charakteristischer Genexpression.
Bezüglich der zentralen Frage zu Interaktionen zwischen olfaktorischen Axonen und ihrem Zielgewebe zeigten Kokultur-Experimente, dass ein Kontakt der Axone mit dem OB Gewebe zunächst eine repulsive Wirkung hatte. Erst eine Vorkultivierung des OB Gewebes resultierte in einer attraktiven Wirkung, wodurch die Axone sogar aus großen Entfernungen vom OB angezogen wurden. Die Anwesenheit des Bulbusgewebes hatte zudem einen positiven Einfluss auf die Wachstumsgeschwindigkeit der Axone. Dabei kam es zunächst zu einer starken Bündelung von Axonen, die in unmittelbarer Nähe des OB wieder in einzelne Fasern defaszikulierten. Diese Ergebnisse zeigten, dass mit dem in dieser Arbeit etablierten Explantatsystem charakteristische Parameter der Generierung olfaktorischer Sinneszellen, des Auswachsens von Axonen und der Interaktion der Axone mit ihrem Zielgewebe in vitro rekapituliert werden konnten. Somit wurden ideale Voraussetzungen dafür geschaffen, um zentrale Fragestellungen zu den molekularen Mechanismen zu bearbeiten, die der Etablierung der einzigartigen Verschaltung in diesem System zugrunde liegen.
Die Explantatkulturen wurden im Folgenden dazu genutzt, die Rolle, die das olfaktorische Rezeptorprotein bei dem Prozess der olfaktorischen Wegfindung spielt, näher zu untersuchen. Durch Expression von genetisch modifizierten Varianten des Odorantrezeptors mOR256-17 in den Explataten konnten neue Einblicke in dessen subzelluläre Lokalisation gewonnen werden. Anhand eines mOR256-17-EGFP Fusionsproteins wurde ein vesikulärer Transport in die Dendriten der Sinneszellen sichtbar, welcher in einer Akkumulation des OR Proteins in den Cilien resultierte. Erstmals wurde mit dieser Technik das OR Protein in vesikulären Strukturen des Axons sichtbar, die anterograd und retrograd transportiert wurden. Der Rezeptor konnte in den Wachstumskegeln wachsender Axone und dort speziell in den Filopodien visualisiert werden. Mittels einer neuartigen Nachweismethode, mit der selektiv Proteine markiert werden können, die in der Plasmamembran lokalisiert sind, konnte ein retrograder Transport von internalisierten mOR256-17 Proteinen beobachtet werden. Die Generierung einer OR-Variante, bei der die Interaktionsdomäne des Rezeptors mit G-Proteinen mutiert wurde, resultierte in einer gestörten Verteilung des OR Proteins in den Sinneszellen.
Insgesamt wurde mit dem in dieser Arbeit etablierten in vitro System ein entscheidendes Werkzeug geschaffen, mit dem bereits neue Einblicke in die Funktion distinkter molekularer Komponenten gewonnen wurde und dessen zukünftiger Einsatz zum weiteren Verständnis der komplexen Prozesse bei der Projektion olfaktorischer Sinneszellen beitragen kann.
Olfactory sensory neurons (OSN) expressing a particular odorant receptor (OR) are widely scattered throughout the olfactory epithelium (OE) of the nose and send their axon into a small number of common glomeruli in the olfactory bulb (OB). In a spatially well conserved pattern these axons establish synaptic contacts to second order neurons. The molecular mechanisms underlying the precise wiring are still not well understood. To generate a system which may facilitate the investigation of distinct aspects of this complex process, an in vitro culture with tissue explants from the olfactory system was established in the present work. The use of tissues from transgenic mice which enabled the visualisation of OSN and their processes by intrinsic fluorescence allowed a continuous observation of distinct axonal populations under defined and manipulable conditions. Cells within an explant from the OE harvested at the embryonic stage 14 (E14) extended numerous axonal processes within a few days which grew out radially and without fasciculation. During the initial culture period the explants contained mainly progenitor cells; after several days in culture cells differentiated to OMP-positive, thus mature OSN. Using receptor specific transgenic mouse lines the expression of distinct OR genes in a subpopulation of OSN could be detected. Altogether, the culture conditions thus allowed the differentiation of progenitor cells into OSN with characteristic gene expression. Concerning the key question of how axons of OSN interact with their target tissue, co-culture experiments with OB tissue were performed; they showed that axons were initially repelled by their target. A precultivation of OB tissue, however, resulted in an attraction of axons even from larger distances. Moreover, the bulb tissue exerted a positive effect on the growth rate of OSN axons. During their growth these axons formed bundles which defasciculated in the vicinity of the OB explants. These results showed that characteristic parameters in the generation of OSN, their axonal growth and interactions with the target tissue were recapitulated by the in vitro culture system, thus, providing optimal conditions for the examination of key questions regarding the molecular mechanisms involved in establishing the unique projection pattern.
Subsequently, the explant culture system was used to investigate the role of the odorant receptor protein in the process of path finding. Expression of genetically modified receptor variants in the explants revealed novel insights into the subcellular localisation of the odorant receptor mOR256-17. An mOR256-17-EGFP fusion protein could be detected in vesicles transported into the dendrite of OSN, resulting in an accumulation of the OR in the cilia. Using this technique it was possible to observe for the first time OR proteins in vesicles which were transported anterogradely and retrogradely along the entire axon. The OR could be visualised within the growth cones and the attached filopodia. Taking advantage of a novel detection method in which proteins integrated into the plasma membrane were selectively marked, retrogadely transported vesicles containing internalised mOR256-17 protein could be observed. The generation of an OR variant, in which the G-protein binding domain was mutated resulted in a disturbed localisation of the OR protein within OSN.
Hence, by developing an improved in vitro explant system, an important tool was generated that allowed novel insights into the function of distinct molecular components and should be valuable for future studies aimed at understanding the complex processes that lead to the precise connection of OSN with their target.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Heinz
Breer
Prof. Dr.
2008-11-14
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-3203
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2009/320/
oai:opus.uni-hohenheim.de:351
2009-04-20T12:29:10Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Interaktion des Photosensors Ppr aus Rhodocista centenaria mit Proteinkomponenten der chemotaktischen Signaltransduktion
Interaction of the photosensor Ppr from Rhodocista centenaria with protein components of the chemotactic signal transduction
Sven
Kreutel
570
Chemotaxis , Methyl-akzeptierende Chemotaxis-Proteine , Phototaxis , Phototrophe Bakterien , Bakterien , MCP
Ppr , Rhodocista , centenaria, Photosensor phototaxis , chemotaxis , Rhodocista , centenaria , Ppr
Rhodocista centenaria ist ein phototrophes alpha-Proteobakterium, das makroskopisch eine unter Purpurbakterien einzigartige phototaktische Reaktion innerhalb eines Lichtgradienten zeigt. Die C-terminale Histidinkinasedomäne Pph des potentiellen Photorezeptors Ppr wurde in der vorliegenden Arbeit im Hinblick auf mögliche Interaktionspartner und der Einbindung in eine Signaltransduktionskaskade untersucht. Erste Hinweise auf potentielle Bindungspartner konnten aus den Ergebnissen der Überexpression des Photosensors bzw. der Histidinkinase auf die chemotaktische Antwort von E. coli gewonnen werden. Bereits geringe Mengen der in E. coli exprimierten Rhodocista Proteine Ppr bzw. Pph sind ausreichend, um die Chemotaxis von E. coli vollständig zu inhibieren. Dies deutete auf eine Interaktion des Photorezeptors mit Komponenten der chemotaktischen Signaltransduktionskaskade hin. Zur Identifikation eines Ppr- bzw. Pph- Bindungspartners wurde das vollständige Ppr-Protein und die C-terminale Histidinkinasedomäne Pph sowie die Proteine des chemotaktischen Netzwerks CheW und CheAY aus R. centenaria in E. coli heterolog exprimiert und gereinigt. In Bindungsstudien, durch Resonanzspiegel-Spektroskopie konnte eine Interaktion der C-terminalen Histidinkinasedomäne (Pph) mit dem CheW-Protein gezeigt und die Dissoziationskonstante Kd zu 0,13 ± 0,026 μM berechnet werden. Zusätzliche Pull-Down-Experimente verifizierten dieses Ergebnis und zeigten zudem eineStimulierung der Interaktion durch die Zugabe von ATP. Die Lokalisation von CheAY im Komplex mit CheW sowie der C-terminalen Histidinkinasedomäne wurde in Pull-Down-Experimenten bestätigt. Diese in vitro gewonnenen Daten konnten durch Expressionsstudien in vivo bestätigt werden. Die Rolle von CheAY als Phosphatgruppenakzeptor im Zwei-Komponenten-System mit Ppr als Photorezeptor sowie die Phosphatgruppenübertragung innerhalb der Signaltransduktionskaskade wurde in Phosphorylierungs- bzw. Transphosphorylierungsexperimenten mit [32P]-γ-ATP untersucht. Aus den Ergebnissen dieser Experimente geht hervor, dass die C-terminale Histidinkinasedomäne des Ppr-Proteins für eine Autophosphorylierungsreaktion ausreichend ist, d.h. andere Domänen des Rezeptors Ppr werden für diese Reaktion nicht benötigt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass CheAY als Phosphatgruppenakzeptor dienen kann und die Histidinkinasedomäne an der Phosphorylierung von CheAY beteiligt ist. Mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit konnte, in Verbindung mit bereits vorhandenen Literaturdaten, ein Modell zur lichtgesteuerten Signaltransduktionskaskade ausgehend vom Ppr-Photorezeptor aufgestellt werden.
Rhodocista centenaria (previously known as Rhodospirillum centenum) is a photosynthetic alpha-proteobacterium which exhibits a unique phototactic response in respect of the direction of light. In this work, the focus is on the potential photoreceptor Ppr and its C-terminal histidine kinase Pph to identify putative binding partners in the signal transduction pathway. The results of overexpression experiments with the Ppr-receptor or the Pph-domain in E. coli indicated that there may be an interaction between the photosensor and the chemotactic signalling pathway. Even cells expressing only small amounts of the R. centenaria proteins showed no chemotactic response at all, whereas uninduced cells exhibited normal chemotactic response on swarm plates as well as in capillary assays. To investigate whether the receptor interacts with components of the chemotactic pathway, the Ppr-protein and the Pph-domain as well as the chemotactic proteins CheW and CheAY of R. centenaria were heterologously expressed in E. coli and purified to homogeneity by affinity chromatography. Binding experiments were carried out by using an IAsys biosensor cuvette system. The results indicated that the kinase domain Pph binds to the chemotactic linker protein CheW with a dissociation constant of 0.13 ± 0.026 μM. Pull-down experiments were made to verify this finding and to investigate the role of ATP in the binding process. The results confirmed our previous observations but in contrast to the complex formation in the E. coli chemotactic pathway, the binding of the C-terminal histidine kinase to CheW was ATP-dependent. To study whether the kinase domain also binds CheW in vivo, expression and coelution experiments with tagged Pph-protein were carried out in R. centenaria. The findings suggest that the complex formation occurs in vivo as well as in vitro. From the data of the E. coli chemotactic complex formation it is well known that CheA is part of the trimeric complex which consists of MCP-receptors, CheW and CheA. To analyse this, pulldown experiments with all three proteins (Pph, CheW and CheAY) were performed.
The results clearly showed a participation of CheAY in the formation of the complex with CheW and the kinase Pph. It is known that the photoreceptor Ppr is autophosphorylated during its light induced photocycle. We therefore examined whether the kinase domain is sufficient for this autophosphorylation reaction and whether CheAY could function as a phosphate acceptor. Our results confirmed the hypothesis that the kinase domain is sufficient for autophosphorylation and that the Pph-protein assists CheAY to take over phosphate groups. Taken together, the results in combination with data from the literature lead to a detailed working model for the function of the photoreceptor Ppr and the signal transduction pathway.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Andreas
Kuhn
Prof. Dr. rer. nat.
2008-06-02
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-3511
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2009/351/
oai:opus.uni-hohenheim.de:373
2009-09-16T12:56:14Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Untersuchungen des Einflusses von Chemotherapie auf Tumor-assoziierte Fibroblasten bei Karzinomen der Lunge und Brust in vivo und in verschiedenen ex vivo Modellen
Investigation of the response of tumor-associated fibroblasts from breast and lung carcinomas to chemotherapy in vivo and in different ex vivo models
Maike
Sonnenberg
570
Krebs <Medizin> , Chemotherapie
Fibroblasten , Gewebekultur , primäre Zellen carcinoma , chemotherapy , fibroblasts , microenvironment , tissue-culture
Die Umgebung genetisch alterierter epithelialer Tumorzellen spielt eine zentrale Rolle im Wachstum und Überleben der Tumore. Für einen Therapieerfolg ist somit nicht nur die Sensitivität der malignen Tumorzellen, sondern auch die Reaktion der Stromazellen wichtig. In dieser Arbeit sollte geklärt werden, ob und wie die Tumor-assoziierten Fibroblasten (TAFs) im Tumorstroma auf Chemotherapie reagieren.
So konnte anhand von neoadjuvant behandelten Mammakarzinomen vor und nach Chemotherapie die Reaktion der TAFs auf Chemotherapie in vivo bewertet werden. Es wurde in dieser Arbeit erstmals nachgewiesen, dass es in Fällen mit einem hohen Aktivitätsgrad der TAFs vor der Therapie zu einem deutlichen Aktivitätsverlust nach Therapie kommt. Das Ansprechen der TAFs auf Chemotherapie ist unabhängig von der Reaktion der Tumorzellen.
Mit dieser in vivo Untersuchung konnte nicht geklärt werden, ob das Tumorstroma ein direktes oder indirektes Ziel der Chemotherapie ist. Daher wurden in dieser Arbeit verschiedene ex vivo Kultursysteme entwickelt, die es ermöglichen, die direkte Reaktion des Tumorstromas auf die Therapie zu beobachten.
Zum einen wurden primäre TAFs aus frischem Gewebe von Mamma- und Bronchialkarzinomen isoliert und in Einzelzellkultur die Sensitivität gegenüber Chemotherapeutika getestet. Zum anderen wurde ein Gewebekultursystem etabliert, um das direkte Therapieansprechen der TAFs und der Tumorzellen in ihrer natürlichen Gewebeumgebung zu untersuchen.
Die Chemosensitivität der primären isolierten TAFs gegenüber Cisplatin und Taxol wurde bestimmt und mit etablierten Tumorzelllinien verglichen. Die TAFs zeigten sich gegenüber Taxol sehr resistent, während sie auf Cisplatin heterogen reagierten. Auch die Entität spielt bei der Sensitivität gegenüber Chemotherapeutika eine große Rolle. Die primären, isolierten TAFs aus Mammakarzinomen waren im Vergleich zu den etablierten Tumorzelllinien relativ resistent gegenüber Cisplatin, während die TAFs aus den Bronchialkarzinomen sich gegenüber der Behandlung genauso heterogen zeigten, wie die etablierten Tumorzelllinien.
Eine mögliche Erklärung für dieses heterogene Ansprechen gegenüber Cisplatin können somatische Mutationen oder Polymorphismen innerhalb von DNA-Schadensreparatur-Genen sein. Es konnte in 28 untersuchten TAFs aus Bronchialkarzinomen keine somatische p53-Mutation detektiert werden, somit konnte ein Zusammenhang mit dem heterogenen Ansprechen gegenüber Cisplatin ausgeschlossen werden. Des Weiteren wurden die Polymorphismen p53-Arg72Pro, ERCC1-Asn118Asn und Mdm2-T/G309 untersucht. Es wurde dabei ein nicht-signifikanter Zusammenhang zwischen der Chemosensitivität der TAFs aus Bronchialkarzinomen und dem p53-Arg72Pro Polymorphismus gefunden, während die ERCC1-Asn118Asn und Mdm2-T/G309 Polymorphismen keine Rolle zu spielen scheinen.
Die Chemosensitivität der TAFs wurde innerhalb ihrer natürlichen Umgebung anhand von Frischgewebeschnitten aus Mamma- und Bronchialkarzinomen untersucht. Die Viabilität der Schnitte wurde über vier Tage Kultivierung sichergestellt und es konnte keine Veränderung der Morphologie des Gewebes während dieser Zeit beobachtet werden. Um die Wirkungen der verwendeten zytotoxischen Substanzen auf die einzelnen Zelltypen innerhalb der Frischgewebeschnitte untersuchen zu können, wurden proliferierende und tote Zellen im Tumor- und Stromabereich immunhistochemisch nachgewiesen und quantifiziert.
Die Frischgewebeschnitte der Mammakarzinome zeigten nach Taxol-Behandlung bei der Hälfte der Fälle einen Rückgang der Proliferation und einen Anstieg der Anzahl toter Zellen in beiden Zellkompartimenten. Die Frischgewebeschnitte aus Bronchialkarzinomen zeigten in neun von 16 Fällen einen Rückgang der proliferierenden Tumorzellen nach Cisplatin-Behandlung. Da das Tumorstroma hier kaum proliferierte, konnte auch kein Ansprechen auf die Behandlung erwartet werden. In den Fällen, die auf die Cisplatin-Behandlung mit Zelltod reagierten, wurde der Anstieg des Zelltods in beiden Zellkompartimenten detektiert.
Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit erstmals gezeigt, dass nicht nur die epithelialen Tumorzellen, sondern auch die TAFs ein wichtiges Ziel der Chemotherapie sind. Die Reaktion der TAFs auf die Chemotherapie ist in unterschiedlichen Entitäten, aber auch innerhalb einer Entität sehr heterogen. Zum einen spielt die Umgebung eine große Rolle beim Ansprechen des Tumorstromas und zum anderen kann davon ausgegangen werden, dass auch der Genotyp Einfluss auf die Reaktion der TAFs gegenüber Chemotherapie nimmt. Die Beobachtung, dass im nativen Tumorgewebe die Tumorzellen parallel mit den TAFs reagieren, lässt die Vermutung zu, dass beide Zelltypen für das Überleben des Tumors wichtig sind und eine Hemmung eines der Kompartimente zur Sensitivierung des anderen führen könnte.
Carcinomas are complex tissues in which the genetically altered epithelial tumor cells interact with their microenvironment, which plays a pivotal role in growth and survival of the whole tumor. Therefore, also the response of the tumor stroma may be important for the therapeutic success. The aim of the study was to clarify how tumor-associated fibroblasts (TAFs) respond to chemotherapy.
We established a grading system for the activity of the TAFs based on cell counts and cell morphology within neoadjuvant treated breast cancer specimens. We compared both the stromal compartment and the tumor compartment before and after therapy to evaluate the response to chemotherapy. In this in vivo study a response of the stromal compartment was detected in samples with a high stromal activity grade before chemotherapy.
To investigate the direct, more acute response of TAFs we established different ex vivo systems. On the one hand, the response to chemotherapy was tested in primary isolated TAFs from tumor tissue. On the other hand, a tissue slice culture was established to investigate the direct effect of the chemotherapy on TAFs and tumor cells within their intact microenvironment.
For the cell culture experiments freshly isolated TAFs from breast and lung tumors were used. The chemosensitivity to Cisplatinum and Paclitaxel of the primary isolated TAFs was determined and compared with a panel of established human tumor cell lines. The TAFs turned out to be resistant to Paclitaxel, whereas they showed a heterogeneous response to Cisplatinum.
One reason for this heterogeneous response to Cisplatinum could be the existence of somatic mutations and/or polymorphisms within DNA-damage response genes. Somatic mutations within the p53 tumor suppressor gene play a critical role in the response of tumor cells to chemotherapeutics. In this study, however, no somatic mutation was detected in any of the TAFs from lung. In other studies, different polymorphisms could be correlated with the sensitivity to cytotoxic stress. In this study, a non-significant trend towards the chemosensitivity of TAFs from lung carcinomas and the p53-Arg72Pro polymorphism could be observed, whereas the ERCC1-Asn118Asn und Mdm2-T/G309 polymorphisms had no influence on the chemosensitivity.
The chemosensitivity of the TAFs was also determined within their microenvironment on the basis of tissue culture experiments performed with breast and lung carcinomas. Tumor tissue slices from breast carcinomas were treated for 72 h with Paclitaxel, whereas the tissue slices from lung carcinomas were treated with Cisplatinum. To investigate the response of the different cell types to the tested chemotherapeutic drugs within the intact microenvironment, the tissue slices were fixed and stained immunhistochemically for proliferative active and dead cells. Half of the cultivated tissue slices from breast carcinomas showed a decrease in cell counts of proliferating cells, whereas half of the cases showed an increase of dead cells after the treatment with Paclitaxel in tumor and stroma cells.
The tissue slices of the lung carcinomas showed a decrease in proliferating tumor cells after Cisplatinum treatment in comparison to the untreated controls. The stroma compartment showed no proliferative activity so one could not expect a response regarding a decrease of proliferating stroma cells. Two cases showed a response to Cisplatinum regarding an increase in cell death in both cell compartments.
Short term exposure to Paclitaxel led to a parallel reaction of both tumor and stromal cells in tissue culture experiments, whereas isolated TAFs from breast tumors turned out to be resistant to Paclitaxel. In contrast, isolated TAFs from lung carcinomas are significantly more sensitive to Cisplatinum than TAFs within their intact microenvironment.
Consequently, the microenvironment of the tumor plays a crucial role in chemosensitivity. The central role of the microenvironment for response of TAFs to cytotoxic drugs is also demonstrated by the results obtained with lung cancer tissues. These observations indicate that, in addition to intrinsic factors, the microenvironment determines the sensitivity of TAFs to cytotoxic therapy.
In summary, this work demonstrates for the first time, not only the tumor cells but also the stromal cells are an important target for the chemotherapy. Intrinsic and extrinsic factors play an important role in chemosensitivity. On the one hand, the tumor microenvironment is responsible for therapy response of TAFs and on the other hand the genotype may play a crucial role in chemosensitivity. Both, tumor and stroma cells react in parallel to chemotherapy, so you can assume that both cell types are responsible for the chemosensitivity. Some therapeutic approaches could be the inhibition of either the tumor or stromal cell compartment to increase the chemosensitivity of the whole tumor.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Martin
Blum
Prof. Dr.
2009-07-06
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-3738
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2009/373/
oai:opus.uni-hohenheim.de:367
2009-09-24T11:46:55Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Nuclear activation of proteasome in oxidative stress and aging
Nukleäre Proteasomaktivierung in oxidativem Stress und Alterung
Betul
Catalgol
570
Histone , Proteasom , NAD-ADP-Ribosyltransferase , DNS-Reparatur
Histone , Proteasome , Poly-ADP-Ribose polymerase , DNA repair
Poly(ADP-ribosyl)ation reactions are of interest in recent years and they take place in DNA repair in different processes especially following oxidative nuclear damage. Proteasomal reactions also take place in repair following oxidative nuclear damage with the degradation of oxidized histones.
Antitumor chemotherapy is generally believed to act via the oxidation of nuclear material in the tumor cells. Adaptation to oxidative stress appears to be one element in the development of long-term resistance to many chemotherapeutic drugs. The 20S proteasome has been shown to be largely responsible for the degradation of oxidatively modified proteins in the nucleus. Tumor cells are supposed to have a higher nuclear proteasome activity than do nonmalignant cells. Poly(ADP-ribosyl)ation reactions take place in the tumor cells as a consequence of chemotherapy. Such a reaction might occur with the 20S proteasome ?which is known to increase the activity- and also with histones ?which is firstly shown to decrease the degradation in this study. After hydrogen peroxide treatment of HT22 cells, degradation of the model peptide substrate suc-LLVY-MCA and degradation of oxidized histones in nuclei increased accompanied by an increase in PARP-1 mRNA expression. In the recovery of the level of protein carbonyls, single strand breaks and 8-OHdG, proteasome and PARP-1 were shown to play a role together. This was tested with inhibitor treatments. The proteasomal activation following poly(ADP-ribosyl)ation of proteasome and the decrease in poly(ADP-ribosyl)ation of histones and increase in the proteasomal degradation of histones following H2O2 treatment confirmed our hypothesis.
The second part of the thesis shows the changes in PARP-1 and proteasome in different aged fibroblasts with population doublings 19, 36, and 56. The nuclear protective mechanisms were shown to be effected during the senescence process. PARP-1 protein amount decreased whereas there was no change in proteasome amount. PARP activation following H2O2 treatment increased only in young and middle aged cells. In the nuclear extracts of young and old cells, poly(ADP-ribosyl)ation potentials were tested with NAD+ addition into the reaction. In addition to that active proteasome and PARP enzymes were added into the reaction and proteasome activity was measured. With active PARP, proteasome activity was increased both in young and old cells whereas there was no increase in old cells without PARP addition. These results show that proteasome activation is mainly limited by PARP activity.
Taken together all results demonstrate the importance of PARP mediated proteasome activation in the repair of oxidatively damaged chromatin.
Poly(ADP-ribosyl)ierungs-Reaktionen sind seit einigen Jahren im Zentrum des wissenschaftlichen Interesses. Sie finden während der DNA-Reparatur, insbesondere nach oxidativer Schädigung des Zellkerns statt. Proteasomale Reaktionen treten ebenfalls nach nukleärem Schaden auf und beinhalten den Abbau oxidierter Histone.
Eine Antitumor-Chemotherapie wirkt in Tumorzellen häufig über die Oxidation nukleärem Materials. Eine Adaptation zu oxidativem Stress ist häufig ein Bestandteil der Entwicklung von Langzeit-Resistenzen gegen viele Chemotherapeutika. Es wurde häufig gezeigt, dass das 20S Proteasom für den Abbau oxidativ modifizierter Proteine im Zellkern verantwortlich ist. Tumorzellen haben eine höhere nukleäre Proteasomaktivität als nichtmaligne Zellen. Poly(ADP-ribosyl)ierungsreaktionen finden im Zellkern als eine Konsequenz der Chemotherapie statt. Solch eine Reaktion erfolgt auch mit dem 20S Proteasom ? gefolgt von einer Erhöhung der Aktivität- und auch mit Histonen, mit der Konsequenz eines reduzierten Abbau, wie in dieser Studie erstmals gezeigt. Nach einer Wasserstoffperoxidbelastung von HT22-Zellen steigt der Abbau des Modellpeptides suc-LLVY-MCA und von oxidierten Histonen im Zellkern ? begleitet von einem Anstieg der PARP-1 mRNA. Die Wiederherstellung des Spiegels der Proteincarbonyle, der Einzelstrangbrüche und des 8-OHdG setzt eine Interaktion von PARP-1 und des Proteasoms voraus. Dieses wurde mit Inhibitor-Studien untersucht. Die proteasomale Aktivierung nach Poly(ADP-ribosyl)ierung und der Abfall einer Poly(ADP-ribosyl)ierung der Histone sowie ein Anstieg des Histonabbaus nach H2O2?induziertem Stress, bestätigten diese Hypothese.
Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Veränderung der PARP-1 und des Proteasoms während der Fibroblastenalterung. Es wurden Zellen mit den Populationsverdopplungen 19, 36 und 56 untersucht. Die nukleären Schutzmechanismen waren vom Seneszenzprozess beeinflusst. Der PARP-1-Proteingehalt fiel, während das Proteasom konstant blieb. Wasserstoffperoxid induzierte eine PARP-Aktivität nur in jungen und mittelalten Zellen. In nukleären Extrakten von jungen und alten Zellen wurde das Poly(ADP-ribosyl)ierungs-Potential nach NAD+ Zugabe gemessen. Zusätzlich wurden aktives Proteasom und PARP hinzugegeben und die Proteasomaktivität gemessen. Nach Addition von aktiver PARP ist die proteasomale Aktivität in jungen und alten Zellen angestiegen, wobei es zu keinem Anstieg in alten Zellen ohne PARP-Addition gab. Diese Untersuchungen zeigen, dass die proteasomale Aktivierung im wesentlichen durch die PARP-Aktivierung limitiert ist.
Zusammengefasst zeigen meine Resultate die Wichtigkeit der PARP-vermittelten proteasomalen Aktivierung in der Reparatur oxidativ geschädigten Chromatins.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Tilman
Grune
Prof. Dr.
2009-06-22
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-3672
application/pdf
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2009/367/
oai:opus.uni-hohenheim.de:386
2009-09-28T09:13:41Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Biomonitoring von Fluorwasserstoff : neue Ansätze zum Einsatz Höherer Pflanzen als Akkumulationsindikatoren
Biomonitoring of hydrogenfluorid
Peter
Blanckart
570
Biomonitoring , Akkumulation , Fluorwasserstoff
Standardisierte Graskultur , Lolium multiflorum lam. , Hydrogenfluoride , Grasskulturen Biomonitoring
Zur Ermittlung von wirkungsbezogenen Immissionsraten bzw. zur Messung der Wirkdosis von Fluorwasserstoffimmissionen nach der VDI 3957 Blatt 2 wird die Standardisierte Graskultur als ein langjährig bewährtes Verfahren mit sehr gutem Erfolg eingesetzt. Für die Ergebnisbeurteilung der Standardisierten Graskultur sind derzeit zwei Richtlinien in Arbeit, die auf der Basis mehrjähriger, umfangreicher Untersuchungen Beurteilungsmaßstäbe und Orientierungswerte bieten. Sie werden als VDI 3857 Blatt 1 und Blatt 2 voraussichtlich als Gründruck im Jahr 2009 veröffentlicht werden. Ebenso wird die Richtlinie VDI 2310 Blatt 3 zurzeit überarbeitet. Mit einer Veröffentlichung (Gründruck) kann ebenfalls im Jahr 2009 gerechnet werden.
Nach Nr. 5.3 der Richtlinie VDI 3957 Blatt 2 sind Proben mit weniger als 2 g Trockensubstanz zu verwerfen. Das Verwerfen der Proben hat jedoch eine zeitliche Beurteilungslücke von 14 Tagen oder gar 4 Wochen zur Folge. In diesem Zusammenhang sollte getestet werden, wie sich die Anreicherung von Fluorid aus der Exponierung mit HF?haltiger Luft bei niedrigeren Wachstumsraten verändert und ob Proben von exponierten Graskulturen, die nicht das in der o.g. VDI-Richtlinie geforderte Mindestgewicht von 2 g Trockensubstanz haben, dennoch zur Beurteilung der Immissionssituation herangezogen werden können. Zur Beurteilung dieser Fragen wurden in einem mit Fluor belasteten Untersuchungsgebiet, der Stadt Ransbach-Baumbach, Expositionsversuche mit der Standardisierten Graskultur und mit modifizierten Verfahren durchgeführt. Parallel zur Bioindikation wurde die Fluoridkonzentration in der Luft mit radialsymmetrischen Passivsammlern als physiko-chemischer Methode erhoben. Hierdurch konnte ein unmittelbarer Vergleich der Schadstoffkonzentration in der Luft mit dem Schadstoffgehalt in den Graskulturen abgeleitet werden.
Die Vermutung, dass es sich im Untersuchungsgebiet um ein Gebiet mit einer ausgeprägten, anthropogen verursachten Belastung mit Fluor handelt, wurde durch die vorliegende Arbeit bestätigt. Das Untersuchungsgebiet in Ransbach-Baumbach kann im bundesweiten Vergleich als ein Hot Spot für erhöhte Fluoridimmissionen angesehen werden. Die Ergebnisse bestätigen, dass Fluoridimmissionen auch aktuell, wenn auch meist nur vereinzelt und kleinräumig begrenzt, selbst in Mitteleuropa noch bedeutsam sind. Entsprechende Beurteilungsgrundlagen für Bioindikationsverfahren (passiv und aktiv) sollten für Fluorid weiterhin erarbeitet werden, auch wenn in großräumigen Bioindikationsmessnetzen immissionsbedingte Fluoridanreicherungen oft nicht mehr regelmäßig untersucht werden. Der Einsatz von Deschampsia flexuosa (L.) Trin. als Akkumulationsindikator konnte in dieser Arbeit nicht als mögliche Alternative zu Lolium multiflorum Lam. bestätigt werden; die Abweichungen der Fluoridkonzentrationen in Deschampsia flexuosa (L.) Trin. und Lolium multiflorum Lam. waren im raum-zeitlichen Vergleich zu groß. Die durchgeführten Messungen mit den radialsymmetrischen Passivsammlern zeigten keine deutliche Beziehung zwischen der Hydrogenfluorid-Konzentration in der Luft und dem Fluoridgehalt F- [µg g-1 TS] in den Loliumkulturen.
Zwischen den Fluoridkonzentrationen und Biomassezuwächsen als Roh- und Trockengewicht von Lolium multiflorum Lam. bestanden nur äußerst geringe Korrelationen (R2 von 0,0258 bzw. 0,0099 an zwei Messstationen). Da bei ökologischen / ökotoxikologischen Freilanderhebungen Korrelationskoeffizienten (R2) von ⥠0,6 erforderlich sind, um auf deutliche Zusammenhänge schließen zu können, muss ein Zusammenhang zwischen Biomassezuwachs und Fluoridkonzentration für den Akkumulationsindikator Lolium multiflorum Lam. verneint werden. Es wird daher empfohlen, bei der Bestimmung immissionsbedingter Stoffanreicherungen wie Fluorid in Pflanzen nach dem Verfahren der standardisierten Graskultur die VDI-Richtlinie 3957 Blatt 2 so zu überarbeiten, dass auch Proben mit weniger als 2 g Trockensubstanz verwendet werden dürfen.
The standardised grass culture as described in VDI guideline 3957 sheet 2 has successfully been used for years to identify pollution related effects and to assess pollution load with hydrogen fluoride. At the moment, two directives are in preparation for the evaluation of the results from the exposure of standardised grass cultures which provide scales for judging and values for orientation on the basis of detailed studies. The directives will be published as VDI 3857 sheet 1 and sheet 2 as green print in 2009. The directive VDI 2310 sheet 3 is being revised as well. Its publication (green print) is also expected for 2009.
According to no. 5.3 of the directive VDI 3957 sheet 2, samples with less than 2 g of dry substance have to be rejected. However, the rejection of these samples leads to a time gap for assessing of 14 days or even of 4 weeks. In this context it should be tested how the accumulation of fluoride after exposure with air containing hydrogen fluoride would be affected at lower growth rates. It should also be tested if samples of exposed grass with a minimum weight of less than the required 2 g of dry substance can be used for determining the pollution situation. To evaluate these problems, exposures were performed with standardised grass cultures and with modified methodology in an area ? the city of Ransbach-Baumbach ? which is highly contaminated by fluorides. Parallel to bioindication, the fluoride concentration in the air was assessed with radial symmetric passive samplers as a physicochemical method. By this means a direct comparison of the concentration of air pollutants with the pollutant concentration in the grass could be performed.
The tests confirmed that the study area is indeed quite contaminated with fluoride from anthropogenic sources. The area around Ransbach-Baumbach can be considered as a hot-spot for higher fluoride concentrations within Germany. The results confirm that fluoride pollution in Central Europe is still an ongoing problem, even though the pollution is mostly scattered and small scale limited.
Therefore, evaluation fundamentals for bioindication methods for fluoride (passive and active) should be worked out for the future, although fluoride accumulations are no longer regularly determined in large scale bioindication monitoring networks.
The application of Deschampsia flexuosa (L.) Trin. as an accumulation indicator as a possible alternative to Lolium multiflorum Lam. could not be confirmed in this study; the deviations of fluoride concentrations in Deschampsia flexuosa (L.) Trin. and in Lolium multiflorum Lam. were too large in the spatiotemporal comparison. The measurements performed with radialsymmetric passive samplers did not show a good relationship between the hydrogen fluoride concentration in the air and the fluoride concentration F- [µg g-1 ds] in the Lolium grass cultures.
There were only very low correlations between the fluoride concentration and the increase of biomass as raw and dry weight of Lolium multiflorum Lam. (R2 of 0.0258 and 0.0099 at two measurement stations, respectively).
Since conventionally an R2 of ⥠0,6 is required to indicate significant relationships in ecological/ecotoxicological field studies, no link between the increase of biomass and fluoride concentration for the accumulation indicator Lolium multiflorum Lam. is concluded.
Therefore, it is recommended to revise the VDI guideline 3957 sheet 2 so that standardised grass culture samples of less than 2 g dry substance are also accounted for in the determination of the accumulation of air pollutants like fluoride in plants.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Andreas
Fangmeier
Prof. Dr.
2009-08-28
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-3861
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Agrarwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2009/386/
oai:opus.uni-hohenheim.de:396
2009-11-23T13:35:07Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Der Einfluss verschiedener Ölemulsionen und der IL-6-Typ-Zytokine CNTF und LIF auf die Differenzierung von 3T3-L1-Präadipozyten zu Fettzellen
The influence of different oil emulsions and of the Il-6 type cytokines CNTF and LIF on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes into adipocytes
Antje
Stäbler
570
Differenzierung , Öl , Cytokine
Adipozyten , CNTF , LIF adipocytes , differentiation , oil emulsions , IL-6 type cytokines
Die sich weltweit epidemieartig ausbreitende Zivilisationskrankheit Diabetes mellitus Typ 2 ist unter anderem gekennzeichnet durch zu hohe Glucose- und Triglyzeridspiegel des Blutes. Für die Entfernung überschüssiger Nährstoffe aus dem Blut ist die Differenzierung von Präadipozyten zu auf die Speicherung großer Fettmengen spezialisierten Adipozyten essentiell. Dieser Vorgang kann im Zellkulturmodell durch die Differenzierung von 3T3-L1-Zellen mit Hilfe von Insulin, IBMX und Dexamethason nachgestellt werden. In dieser Arbeit wurde ein ausgleichender Effekt einer Oliven- bzw. Sojaölinkubation auf den Differenzierungsprozess in 3T3-L1-Zellen nachgewiesen. Die durch den Zusatz von Insulin, IBMX und Dexamethason initialisierte Differenzierung wurde durch beide Öle etwas gehemmt, während sowohl Oliven- als auch Sojaöl in undifferenzierten Präadipozyten ein gewisses Differenzierungspotential besitzen. Dies weist auf Vorteile bestimmter, mit der Nahrung zugeführter Öle gegenüber den als Antidiabetika eingesetzten Thiazolidindionen hin, welche langfristig zu einer Gewichtszunahme führen. Des Weiteren konnte die durch das proinflammatorische Zytokin TNFα induzierte Differenzierungsinhibition durch beide Öle in gewissem Maße ausgeglichen werden. Als Marker für den Differenzierungsstatus wurde der Transkriptionsfaktor PPARγ herangezogen. Das am Auf- und Abbau intrazellulärer Fettspeicher beteiligte Caveolin1 wurde sowohl in differenzierten als auch in undiffe-renzierten 3T3-L1-Zellen durch die Öle induziert.
Außerdem wurde die Signaltransduktion des IL-6-Typ-Zytokins CNTF in 3T3-L1-Zellen untersucht sowie dessen Einfluss auf die Differenzierung dieser Zellen überprüft. CNTF ist in den letzten Jahren zunehmend wegen seiner leptinähnlichen Wirkung, die auch im leptinresistenten Zustand erhalten bleibt, ins Zentrum des Interesses gerückt. In der vorliegenden Arbeit konnte eine Zunahme der Sensitivität von 3T3-L1-Zellen gegenüber CNTF während der Differenzierung gezeigt werden. Des Weiteren wurde die positive Wirkung des Zytokins auf den Fettsäuremetabolismus und die Fettzelldifferenzierung bestätigt. Die Bildung vieler kleiner Fettzellen wurde unter dem Einfluss von CNTF gegenüber der Bildung einer geringeren Zahl größerer Fettzellen bevorzugt, wodurch die Funktionalität der Zellen günstig beeinflusst und der Schutz vor der Entstehung einer Insulinresistenz erhöht wird. Das ebenfalls zur Gruppe der IL-6-Typ-Zytokine gehörende LIF glich in seiner Wirkung nicht CNTF, sondern war tendenziell mit den Ölen vergleichbar.
Type 2 diabetes is a disease of civilization spreading all over the world like an epidemic. Among other things it is characterized by increased glucose and triglyceride levels of the blood. Thus the differentiation of preadipocytes into adipocytes that are specialized in storing large fat depots is essential for the removal of excess nutrients from the circulation. This process can be simulated through the differentiation of 3T3-L1 cells by treatment with insulin, IBMX, and dexamethasone. In this study a compensative effect of olive oil as well as soy bean oil on the differentiation of 3T3-L1 cells was found. The differentiation triggered by insulin, IBMX, and dexamethasone was somewhat inhibited by incubating the cells with one of the two oils, whereas both olive and soy bean oil had a certain potential to act as differentiating agents them-selves when insulin, IBMX, and dexamethasone were not added. This points to benefits of certain oils contained in food compared to thiazolidinediones that are used as antidiabetics and lead to weight gain in the long term. Furthermore the inhibitory effect of the proinflammatory cytokine TNFα on the differentiation process could be compensated to some degree by either oil. The transcription factor PPARγ was used to measure the state of differentiation. Caveolin1 is involved in both buildup and degradation of intracellular fat stores and was induced by oil incubation in differentiated as well as in undifferentiated 3T3-L1 cells.
Moreover the signal transduction of the IL-6-related cytokine CNTF in 3T3-L1 cells and its influence on the differentiation process of these cells was investigated. In recent years CNTF was spotlighted because of its leptin-like properties that persist even in leptin resistant states. In this study an increasing sensitivity to CNTF during the differentiation of 3T3-L1 cells was shown. Furthermore the positive effects of the cytokine on fatty acid metabolism and adipocyte development were verified. CNTF favored the emergence of many small adipocytes compared to fewer, but larger adi-pocytes under different conditions. Thereby the functionality of the cells is influenced in a positive way and the protection from the development of insulin resistance is increased. The effect of LIF - another IL-6-related cytokine - was not similar to that of CNTF but was more comparable to the effect of the oils.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Lutz
Graeve
Prof. Dr.
2009-10-20
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-3966
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2009/396/
oai:opus.uni-hohenheim.de:401
2009-12-14T11:04:21Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Delimitation of the organizer from the posterior notochord : descriptive and functional studies in mouse and African clawed frog
Abgrenzung des posterioren Notochords vom Organisator : beschreibende und funktionelle Studien in Mäusen und afrikanischen Krallenfröschen
Philipp
Andre
570
Embryonalentwicklung , Organisator <Embryologie> , Gastrulation , Lateralität
Brachyury Development , Organizer , Gastrulation , Laterality , Brachyury
During vertebrate development, gastrulation is probably the most important phase, as the future body plan is established. Thereby the three body axes anterior-posterior, dorsal-ventral and left-right are determined as well. A central role thereby is taken by the Spemann organizer, as this part of the embryo governs the above mentioned processes. The left-right axis is specified by an extracellular leftward fluid-flow, which results in asymmetric gene expression of the TGFβ factor Nodal. In mice the ciliated epithelium responsible for the fluid-flow as well as the organizer are denominated as ?node?. In contrast to that two distinct entities are thought to be responsible for organizer function and fluid-flow in zebrafish, Xenopus and rabbit embryos. In the present study, it could be shown that this also applies for mouse embryos. In order to prevent further confusion the ciliated epithelium responsible for the fluid-flow was denominated as posterior notochord (PNC) as it is in continuity with the notochord but located anterior to the organizer (?node?). The latter is characterized by the expression of the homeobox gene Goosecoid (Gsc). Gsc possesses, like the tissue of the organizer, the potential to induce an almost complete axis and became therefore famous as ?the organizer gene?. However upon knockout of Gsc in the mouse, surprisingly no gastrulation defects could be detected. Therefore the function of Gsc during gastrulation was investigated using a gain-of-function approach. The analysis of this, in the present and previous studies, indicated that Gsc acts as a switch between two modes of cell movement. Accordingly, Gsc promotes active cell migration and inhibits convergent extension movements.
Furthermore it was investigated whether the monoamines adrenaline and serotonin have an influence on the cilia and thus on the leftward fluid-flow, as it was reported in rat and Xenopus experiments. Thereby it could be detected that the addition of adrenaline led to a reduction of the ciliary beat frequency (CBF) and therefore the fluid-flow was attenuated. In contrast to that the addition of serotonin or its antagonists resulted only in minor changes of CBF and thus had no measurable effect on the fluid-flow.
The consequences of a malformed PNC were analyzed using embryos mutant for Brachyury (T). Thereby, it was shown that embryos homozygous for this mutation did not develop a functional PNC and thus lacked the fluid-flow. Furthermore a possible cause for the absence of asymmetric Nodal in these embryos was brought into context of an attenuated expression of Fgf8. This indicated that T possesses two distinct roles in left-right development. On the one hand it is necessary for the correct formation of a PNC and on the other hand it is probably needed to maintain the expression of Fgf8, which is a prerequisite for the transcription of Nodal. Finally it was investigated whether these functions were conserved from the African clawed frog Xenopus. Thereby, it could be shown, that Xbra, the homologous gene of T in Xenopus, was also necessary for the formation of the gastrocoel roof plate, the homologous structure of the PNC. Additionally it was observed that the absence of Xbra led to an attenuation of Nodal expression in the midline of Xenopus embryos. This implied that not only the function of Brachyury, but also the process of laterality determination is highly conserved between mammals and amphibians.
Während der Entwicklung der Wirbeltiere stellt die Gastrulation die vermutlich wichtigste Phase dar, da sie sich durch die Anlage des zukünftigen Körperbauplans auszeichnet. Dabei werden auch die drei Körperachsen Anterior-Posterior, Dorsal-Ventral und Links-Rechts bestimmt. Eine zentrale Rolle nimmt hierbei der sog. Spemann-Organisator ein, da dieser Teil des Embryos die oben genannten Prozesse steuert. Die Links-Rechts-Achse wird als letzte spezifiziert. Dies geschieht durch eine extrazelluläre, linksgerichtete Flüssigkeitsströmung, die eine links-asymmetrische Genexpression des TGFβ Faktors Nodal zur Folge hat. In Mausembryonen wird das für diese Strömung verantwortliche Epithel darüber hinaus als Homolog des Spemann Organisators betrachtet und als ?node? bezeichnet. In den Wirbeltieren Zebrabärbling, Krallenfrosch und Kaninchen sind im Gegensatz dazu zwei verschiedene Strukturen für Organisatorfunktion und Flüssigkeitsströmung verantwortlich. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass es sich in der Maus ebenfalls um zwei verschieden Einheiten handelt. Um weitere Verwechslungen auszuschließen wurde das cilierte Epithel, das für den Flüssigkeitsstrom verantwortlich ist, als posteriores Notochord (PNC) bezeichnet, da es sich in Kontinuität mit dem restlichen Notochord befindet, aber anterior des Organisators (?node?) liegt. Dieser wird durch die Expression des Homöoboxgens Goosecoid (Gsc) charakterisiert. Gsc besitzt, wie das Gewebe des Organisators, die Fähigkeit eine beinahe vollständige Körperachse zu induzieren und wurde daher als ?das Organisator Gen? berühmt. Durch den Funktionsverlust von Gsc in der Maus wurde überraschenderweise aber keine bemerkbare Beeinträchtigung der Gastrulation festgestellt. Daher sollte mittels Funktionsgewinn untersucht werden, welche Funktion Gsc während der Gastrulation besitzt. Die Analysen in dieser und in vorangegangen Arbeiten zeigte, dass Gsc vermutlich als Schalter zwischen zwei verschiedenen Zellbewegungsmodi fungiert, indem es die aktive Migration unterstützt und den Prozess der konvergenten Extension inhibiert.
Darüber hinaus wurde untersucht, ob die Monoamine Serotonin und Adrenalin einen Einfluss auf Cilien des PNCs und damit auf den linksgerichteten Flüssigkeitsstrom haben, da es dafür Hinweise aus Ratten- und Froschexperimenten gibt. Dabei zeigte sich, dass die Zugabe von Adrenalin in einer Reduktion der Cilienschlagfrequenz (CBF) resultierte und somit auch die Flüssigkeitsströmung abgeschwächt wurde. Im Gegensatz dazu veränderte die Zugabe von Serotonin oder dessen Antagonisten die CBF nur in geringem Maße und hatte daher keinen entscheidenden Einfluss auf die Flüssigkeitsströmung.
Die Fehlbildung eines PNCs wurde anhand der Brachyury (T) Mutante untersucht. Dabei zeigte sich, dass Embryonen, die diese Mutation homozygot tragen, kein funktionelles PNC ausbilden und daher auch über keinen Flüssigkeitsstrom verfügen. Darüber hinaus wurde nach einer Ursache für das Fehlen der asymmetrischen Expression von Nodal in diesen Embryonen gesucht. Dies konnte in Zusammenhang mit einer Abschwächung der Expression von Fgf8 gebracht werden. Daraus folgte, dass T zwei verschiedene Funktionen bei der Entwicklung der Links-Rechts-Achse einnimmt. Einerseits wird es benötigt um ein funktionelles PNC auszubilden, andererseits ist es vermutlich dafür verantwortlich, dass die Expression von Fgf8 erhalten bleibt und damit die Transkription von Nodal ermöglicht wird. Abschließend wurde T auf eine mögliche Konservierung seiner Funktionen im afrikanischen Krallenfrosch untersucht. Dabei zeigte sich, dass Xbra, das homologe Gen von T im Krallenfrosch, ebenfalls für die Morphogenese der Dachplatte des Archenterons, der homologen Stuktur des PNCs, notwendig ist und in Abwesenheit von Xbra die Expression von Nodal beeinträchtigt ist. Daraus konnte geschlossen werden, dass nicht nur die Funktion von Brachyury, sondern auch der Prozess der Links-Rechts Entwicklung zwischen Säugetieren und Amphibien hoch konserviert ist.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Martin
Blum
Prof. Dr.
2009-11-13
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-4016
application/pdf
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2009/401/
oai:opus.uni-hohenheim.de:406
2010-01-11T08:32:29Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Aktivierung eines neuartigen Apoptose-Signalweges durch den Proteinkinaseinhibitor Staurosporin
Activation of a novel apoptotic signaling pathway by the protein kinase inhibitor staurosporine
Merle
Daubrawa
570
Apoptosis , Staurosporin , Phosphorylierung
Überwindung von Chemotherapeutika-Resistenz apoptosis , staurosporine , phosphorylation , chemotherapy-resistance
Der Proteinkinaseinhibitor Staurosporin induziert Apoptose über die Aktivierung des intrinsischen Signalweges. Zunächst wurde Staurosporin als spezifischer PKC-Inhibitor beschrieben, wird inzwischen jedoch als Breitbandkinaseinhibitor verwendet. Staurosporin wird als potenter Apoptose-Induktor eingesetzt, wobei der Mechanismus der apoptotischen Wirkung noch nicht aufgeklärt werden konnte. Darüber hinaus besitzt Staurosporin offensichtlich das Potenzial durch Aktivierung eines neuartigen intrinsischen Apoptose-Signalweges, Chemotherapie-resistente Tumore zu eliminieren. Verschiedene Staurosporin-Derivate wie z.B. UCN-01, PKC-412 oder Enzastaurin werden in klinischen Studien der Phase I-II für die Krebstherapie getestet.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von Bcl-2 weder J16- bzw. JE6.1-Jurkat T-Lymphozyten noch DT40 B-Lymphozyten vor der Caspase-abhängigen Apoptose-Induktion durch Staurosporin schützt. Nach Herstellung apaf-1 -/- DT40-Zellen konnte demonstriert werden, dass Staurosporin auch in Abwesenheit von Apaf-1 und damit unabhängig vom Apoptosom Apoptose induziert. Mit Hilfe der generierten caspase-9 -/- DT40-Zellen konnte Caspase-9 als zentrales Protein beider Staurosporin-induzierter Apoptose-Signalwege identifiziert werden. Durch die Verwendung spezifischer Inhibitoren bekannter und putativer Caspase-9-Kinasen konnte keine Beteiligung der entsprechenden Kinasen an der Staurosporin-induzierten Apoptose nachgewiesen werden. Mit Hilfe der Generierung phospho-mimikrierender und phospho-defizienter Caspase-9-Varianten konnte S183 als essentieller Phosphorylierungsrest während der Staurosporin-induzierten Apoptose identifiziert werden. Es konnte im Weiteren gezeigt werden, dass ein N-terminaler Tag an Caspase-9 die Apoptosom-Bildung nach Behandlung mit Chemotherapeutika blockiert. Im Gegensatz dazu ist Staurosporin weiterhin in der Lage, Apoptose über die N-terminal markierte Caspase-9 zu induzieren
In zukünftigen Arbeiten könnte die mögliche Rolle von Cathepsinen innerhalb dieses neuartigen Signalweges durch spezifische Inhibition analysiert werden. Ferner wäre es möglich, durch Kombinationsexperimente mit spezifischen Inhibitoren der Caspase-9-Kinasen eine Aussage über ein Zusammenwirken verschiedener Kinasen zu treffen. In weiteren Studien muss untersucht werden, ob der Einfluss des S183 während der Staurosporin-induzierten Apoptose auf eine Konformationsänderung der Caspase-9 oder auf eine Phosphorylierung zurückzuführen ist. Durch die Generierung weiterer Caspase-9-Varianten, z.B. deltaCARD-Caspase-9 oder eine nicht-spaltbare Caspase-9, kann ein weiterer Einblick in die Funktion der Caspase-9 in der Staurosporin-induzierten Apoptose gewonnen werden. Dazu können ebenfalls die im Rahmen dieser Arbeit generierten caspase-9 -/- DT40-Zellen sowie mit verschiedenen Caspase-9-Varianten rekonstituierte Zellen herangezogen werden. Durch eine massenspektrometrische Analyse könnte das Phosphorylierungsmuster der Caspase-9 während der Staurosporin-induzierten Apoptose untersucht werden. In Xenograft- oder Chorioallantoismembran-Modellen kann untersucht werden, ob das Staurosporin-Derivat UCN-01 diesen neuartigen Apoptose-Signalweg auch in vivo induzieren kann. Die Identifizierung des Mechanismus und der entsprechenden Effektorproteine des durch Staurosporin induzierten neuartigen Apoptose-Signalweges würde dann die Möglichkeit eröffnen, innovative Agenzien zur Eliminierung Chemotherapie-resistenter Tumore zu entwickeln.
The protein kinase inhibitor staurosporine induces apoptosis via the activation of the intrinsic pathway. First staurosporine was described as a specific PKC inhibitor. Today it is known as a broad range kinase inhibitor and is used as a potent apoptosis inductor. However, the mechanism of the apoptotic effect remains elusive. Furthermore, staurosporine obviously exhibit the potential to eliminate chemotherapy resistant tumors by the induction of a novel intrinsic apoptotic signaling pathway. Different derivatives of staurosporine, e.g. UCN-01, PKC-412 or Enzastaurin are already tested in clinical trials phase I-II for cancer therapy.
In the present work it could be shown that overexpression of Bcl-2 does not impede the caspase-dependent induction of apoptosis in J16- and JE6.1-Jurkat T-lymphocytes or in DT40 B-lymphocytes following staurosporine treatment . After generation of apaf-1 -/- DT40 cells it was demonstrated that staurosporine induces apoptosis despite the absence of Apaf-1 and therefore independently of the apoptosome. Together with the generated caspase-9 -/- DT40 cells, caspase-9 was identified as the central effector protein of both staurosporine-induced apoptotic pathways. The involvement of published and putative caspase-9 kinases could not be confirmed by the usage of specific inhibitors. Using phospho-mimicking and phospho-deficient caspase-9 variants, S183 could be identified as an essential phosphorylation site during staurosporine-induced apoptosis. In addition, after treatment with anticancer drugs apoptosome formation was blocked by an N-terminal tag of caspase-9. However, this tag could not prevent staurosporine-induced apoptosis.
In further studies the potential role of cathepsines for this novel apoptosis signaling pathway could be analysed by their specific inhibition. In order to investigate the involvement of multiple kinases in this novel apoptotic signaling pathway, combination experiments with specific inhibitors of the respective kinases should be accomplished. Further investigations should clarify whether the influence of S183 on staurosporine-induced apoptosis is based on conformational alteration or on phosphorylation of caspase-9. The generation of additional caspase-9 variants including deltaCARD-caspase-9 or non-cleavable caspase-9 could lead to a deeper understanding of the role of caspase-9 for staurosporine-induced apoptosis. For this purpose caspase-9 -/- DT40 cells and cells reconstituted with different caspase-9 variants could be employed. The phosphorylation pattern of caspase-9 could be determined by mass spectrometric analysis. Xenograft or chorio allantois membrane models were used to investigate if the staurosporine derivative UCN-01 is also able to induce this novel apoptosis signaling pathway in vivo. The identification of both the mechanisms and the effector proteins of this staurosporine-induced apoptotic signaling pathway should provide the opportunity to develop novel agents for the elimination of chemotherapy-resistant tumors.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Lutz
Graeve
Prof. Dr.
2009-12-03
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-4064
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/406/
oai:opus.uni-hohenheim.de:408
2010-01-12T07:46:28Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Biochemical investigations on genetically modified oil crops
Biochemiche Untersuchungen an gentechnisch modifizierten Ölpflanzen
Enas
Mekawi
570
Ölpflanzen
MON810, Cry1Ab, Ölpflanzen MON810, Cry1Ab, Oil crops
The main purpose of this study was to develop a method of purification and characterization of Cry1Ab isolated from MON810 genetically modified maize. The second object was to study the effect of the genetic modification of MON810 and high-oleic sunflower on the oil composition. Therefore, the following investigations were performed:
(1) Quantification of Cry1Ab toxin in different corn plant parts.
(2) Development of a suitable method for purification of Cry1Ab from MON810.
(3) Establishment of characterization method for Cry1Ab by mass spectrometry with regard to high peptide sequence coverage.
(4) Evaluation of the effect of genetic modification on the oil composition compared with the conventional traits.
The following results were obtained:
Screening of Cry1Ab by ELISA is the most predominant technique for determination of Cry toxin content in plants. The determination of the toxin concentration resulted in highest levels for leaves (26.8 µg/g dry matter), while it was 1.5, and 1.0 µg/g for stalks and grains respectively. In our study, toxin content in leaves was about six times higher than in a previous study. There are no data available for the dry weight content of Bt toxins in stalk and grain, which could be compared to the obtained results.
Although MON810 maize is one of the major genetically modified crops, informations on the character of the Cry1Ab purified from the MON810 maize is still limited, although such data are important for safety assessment studies. To my best knowledge, this study is the first investigation charactizing Cry1Ab toxin isolated from MON810 maize.
The results of the present investigation indicated that the separation of the Cry1Ab protein from MON810 leaf extracts by HPLC techniques was not efficient. MALDI-TOF analyses showed that the major component separated with Cry1Ab was β-D glucosidase, which may be due to resembled isoelectric points.
However, immuno-affinity purification using self-prepared affinity columns was very efficient to isolate pure Cry1Ab from MON810. The characterization of purified Cry1Ab was successfully done by SDS-PAGE, Western blot analysis and MS techniques.
MALDI-TOF MS analyses were useful for component screening of Cry1Ab. Results showed that Cry1Ab is subjected to truncation by plant proteases into a core toxin with approximately 69 kDa. LC(ESI)-MS/MS gave a higher sequencing coverage of Cry1Ab (73 % of peptide sequence) compared to MALDI-TOF analysis (41% of peptide sequence). Further studies revealed that Cry1Ab had no detectable potential carbohydrates which might be covalently linked to the protein.
The capillary electrophoresis technique was used for determination of the Cry1Ab purified from MON810 maize and proved to be a suitable method for determination of the Cry1Ab, but it was not successful for the detection of very low quantities (less than 0.03 mg/ml).
Peptide mapping is one of the most powerful tools for protein identification and characterization. The use of HPTLC with the relatively new plates (ProteoChrom) was identified as a convenient tool for peptide mapping as compared to capillary electrophoresis, especially if put into consideration that HPTLC is less costly than capillary electrophoresis. The HPTLC method was able to resolve 13 peptides, while capillary electrophoresis resolved 19 peptides, obtained from the digested Cry1Ab toxin.
Concerning lipid analyses, fatty acids and sterols were determined by gas chromatography, tocopherols by HPLC. For the determination of phospholipids, an HPTLC method was developed, resulting in lower detection limits than reported in previous studies.
The present study proved that the genetic modification did not significantly affect the contents of fatty acids, sterols, tocopherols and phospholipids in transgenic maize oil. Apart from the increased amount of oleic acid in high-oleic sunflower oil, the genetic modification in sunflower did not produce unexpected effects on the oil composition. Therefore, with regard to the oil composition, both oils from genetically modified plants will be as safe as conventional oil types.
Das Hauptziel dieser Arbeit war es, ein Verfahren zur Aufreinigung und Charakterisierung des Toxins Cry1Ab in dem gentechnisch modifiziertem Mais MON810 zu entwickeln. Weiterhin war es das Ziel, die Auswirkungen der genetischen Veränderung von MON810 und high-oleic Sonnenblumen auf die Lipid-Zusammensetzung zu studieren. Daher wurden folgenden Untersuchungen durchgeführt:
(1) Quantifizierung des Cry1Ab-Toxins in verschiedenen Teilen der Maispflanze.
(2) Entwicklung einer geeigneten Methode zur Reinigung von Cry1Ab aus MON810.
(3) Charakterisierung von Cry1Ab mit Hilfe der Massenspektrometrie.
(4) Chemische Analyse der Öl-Zusammensetzung von MON810 Maisöl und high-oleic Sonnenblumenöl im Vergleich zu konventionellen Ölen.
Folgende Resultate wurden erzielt:
Die Bestimmung von Cry1Ab in MON810 Mais mittels ELISA ergab die höchsten Konzentrationen in Blättern (26,8 μg/g Trockenmasse), während die Gehalte im Stengel und im Korn deutlich niedriger ausfielen (1,5 bzw. 1,0 μg/g Trockenmasse). Die in den Blättern bestimmten Gehalte waren etwa sechsfach höher als in einer früheren Literaturstudies. Für Stengel und Korn gibt es keine Vergleichsdaten in der verfügbaren Literatur.
Obwohl MON810 Mais eine der wichtigsten gentechnisch veränderten Nutzpflanzen ist, sind proteinchemische Informationen zu Cry1Ab begrenzt, eine wesentliche Voraussetzung für Sicherheitsbewertungen. Nach meinem besten Wissen liefert die vorliegende Arbeit die ersten Ergebnisse zur Charakterisierung des Cry1Ab-Toxins aus MON810 Mais.
Die durchgeführten Untersuchungen zeigten, dass die Aufreinigung des Toxins aus Blattextrakten mittels HPLC nicht effizient war. MALDI-TOF-Analysen ergaben, dass die isolierte Hauptkomponente insbesondere mit dem Enzym β-D-Glucosidase verunreinigt war, wahrscheinlich auf ähnliche isoelektrische Punkte zurückzuführen.
Dagegen erwies sich die Immuno-Affinitätsextraktion an selbst hergestellten Immuno-Affinitätssäulen als sehr effizient und erlaubte die Untersuchungen rein vorliegenden Cry1Ab mittels SDS-PAGE, Western-Blot-Analyse und MS-Techniken.
Die Charakterisierung durch MALDI-TOF-Analysen zeigte, dass Cry1Ab durch pflanzliche Proteasen auf ein Kernprotein von etwa 69 kDa zugeschnitten wird. Mit Hilfe der LC(ESI)-MS/MS konnte eine höhere Abdeckung von Cry1Ab-Peptiden (73% der Peptid-Sequenz) im Vergleich zur MALDI-TOF-Analyse (41% der Peptid-Sequenz) erreicht werden. Weitere Studien zeigten, dass Cry1Ab keine potenziell nachweisbaren Kohlenhydrate aufwies, die kovalent an das Toxin gebunden sind.
Die Capillarelektrophorese erwies sich als eine geeignete Methode zur Bestimmung von Cry1Ab, isoliert aus MON810, leider aber eignete sie sich nicht zur Bestimmung sehr geringer Mengen (weniger als 0,03 mg/ml).
Peptid-Mapping ist eine der besten Methoden zur Protein-Identifizierung und Charakterisierung. Im Vergleich zur Capillarelektrophorese oder HPLC stellte die HPTLC auf speziellen ProteoChrom-Schichten eine preisgünstige und schnelle Alternative zum Peptid-Mapping dar. Mit der HPTLC-Methode konnten 13 Peptide aufgetrennt werden, während die Capillarelektrophorese Signale für 19 Peptide nach tryptischem Verdau von Cry1Ab lieferte.
Im Rahmen der Lipidanalytik wurden die Fettsäure- und Sterinverteilung mittels Gaschromatographie, das Tocopherolmuster mittels HPLC untersucht. Zur Bestimmung der Phospholipide wurde eine HPTLC-Methode entwickelt, mit der geringere Nachweisgrenzen erreicht wurden als in den beschriebenen Methoden.
Die erhaltenen Ergebnisse zu MON810 Maisöl zeigten keine Unterschiede zu konventionellem Maisöl. Abgesehen vom höheren Ölsäuregehalt konnten auch beim high-oleic Sonnenblumenöl keine Differenzen zu konventionellem Sonnenblumenöl aufgedeckt werden. Insofern kann es hinsichtlich der Lipidzusammensetzung keine Sicherheitsbedenken bei den beiden Ölen aus getechnisch modifizierten Pflanzen geben.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Wolfgang
Schwack
2009-12-08
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-4086
application/pdf
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/408/
oai:opus.uni-hohenheim.de:419
2010-04-19T16:30:46Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Regulation von NIMIN- und PR1-Genen aus Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. und Nicotiana tabacum (L.) in der Salicylat-abhängigen Pathogenabwehr
Regulation of NIMIN und PR1 genes in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. and Nicotiana tabacum (L.) in the salicylic acid dependent pathogen defense
Meike
Hermann
570
Ackerschmalwand , Tabak , Genanalyse
NIMIN, as-1-ähnliche Elemente, PR1, NPR1, systemisch aktivierte Resistenz (SAR) as-1 element , plant resistance genes
Die systemisch aktivierte Resistenz (SAR) ist ein wichtiger Verteidigungsmechanismus der Pflanzen gegenüber Pathogenen. NPR1 übernimmt dabei die Rolle eines zentralen Regulators, der im Zusammenspiel mit TGA-Transkriptionsfaktoren die Salicylat (SA)-abhängige Ausbildung der SAR kontrolliert, die letztendlich zur Induktion von PR (pathogenesis-related) -Proteinen führt. Die SA-aktivierte Expression der PR1-Gene aus Arabidopsis thaliana (At) und Nicotiana tabacum (Nt) ist abhängig von as-1-ähnlichen cis-aktiven Elementen mit der Sequenz TGACG. In dieser Arbeit wurden neue Erkenntnisse zur funktionellen Bedeutung der NIMIN-Proteine und zur SA-abhängigen PR-Induktion gewonnen. In Arabidopsis gibt es 4 NIMIN-Gene - N1, N2, N3 und N1b, die unabhängig von TGA-Faktoren mit NPR1 interagieren. N1 und N2 besitzen ein gemeinsames Interaktionsmotiv und binden an den C-Terminus von AtNPR1, während N3 an den N-Terminus von AtNPR1 bindet. Relativ zentral in AtNPR1 liegt die Bindestelle für die TGA-Faktoren. Die Untersuchung der Expression der NIMIN-Gene im SAR-Signalweg sowie ihre mögliche Involvierung im Jasmonat (JA)-Signalnetzwerk sollte neue Hinweise zur Regulation der pflanzlichen Pathogenabwehr geben. Dabei wurde die Bedeutung von unterschiedlichen as-1-ähnlichen Elementen durch die Etablierung eines Hefe-Einhybridsystems analysiert.
N1b ist vermutlich ein inaktives Pseudogen. Weder konnten in unbehandelten, SA- oder JA-behandelten Arabidopsis-Pflanzen Transkripte nachgewiesen werden noch war eine Konstruktion N1b[GUS] mit der 1135 Bp 5?-Region in der Lage, Reportergenexpression in transgenen Tabakpflanzen zu vermitteln. N3 wird in geringen Mengen konstitutiv und unabhängig von NPR1 exprimiert. Die Behandlung mit SA oder JA führt nicht zur Induktion von N3. Gleichermaßen lässt sich der N3-Promotor nicht durch die Behandlung mit SA, JA, TMV, H2O2 und Phytohormonen beeinflussen. Die Reportergenexpression des N3-Promotors erfolgt in Keimlingen transgener Tabakpflanzen konstitutiv.
N1 und N2 sind dagegen eindeutig SA-induziert. Die Expression von N2 erfolgt nach einem SA-Stimulus unmittelbar und anhaltend und ist NPR1-unabhängig. N1 wird zu einem späteren Zeitpunkt transient exprimiert und ist dagegen NPR1-abhängig. Die Expression von N1 und N2 liegt dabei zeitlich klar vor der Expression des PR1-Gens. Die Analyse von GUS-Reportergenkonstruktionen bestätigt die zeitlich vorgezogene SA-abhängige Induktion des N1- und N2-Promotors vor der Aktivierung des NtPR1a-Promotors. Beide NIMIN-Promotoren lassen sich ? ähnlich dem NtPR1a-Promotor - außerdem durch Thiamin-HCl induzieren und zeigen bei gleichzeitiger Behandlung mit SA und JA einen reprimierenden Einfluss des JA-Signalnetzwerks auf die Stärke der Reportergenexpression. Auf histologischer Ebene zeigen der N1- und N2-Promotor eine SA-abhängige Aktivierung im Blatt- und Wurzelgewebe von jungen Tabakkeimlingen. Diese Aktivität unterscheidet sich klar vom N3-Promotor.
Der N2-Promotor ? wie auch der AtPR1- und NtPR1a-Promotor ? besitzt ein as-1-ähnliches Element, das für die SA-Sensitivität des Promotors verantwortlich ist und das auf der Tandemwiederholung der Sequenz TGACG beruht Die Struktur des N2-as-1-ähnlichen Elements ist allerdings unterschiedlich zur Struktur der as-1-ähnlichen Elemente in den PR1-Promotoren.
Im N1-Promotor konnte ein SA-responsives Element in der Region von -436 bis -402 bezogen auf den Translationsstart des N1-Gens lokalisiert werden. Die Mutation einer TGATG-Wiederholung in dieser Region ergab aber keinen Verlust der Promotoraktivität.
Durch die Untersuchung chimärer Promotorkonstruktionen mit fremden as-1-ähnlichen Elementen konnte gezeigt werden, dass die unterschiedliche Kinetik der Expression von PR1- und NIMIN-Genen nicht durch die genetische Information der as-1-ähnlichen Elemente codiert wird. Im Gegensatz dazu üben die cis-aktiven Elemente eindeutig einen Einfluss auf die Gewebespezifität der Promotoren aus. Der NtPR1a-Promotor, der nach SA-Induktion lediglich im Blattgewebe aktiv ist, übernimmt durch den Einbau des N2-as-1-ähnlichen Elements die NIMIN-typische Aktivität im Wurzelgewebe SA-induzierter Keimlinge. Die Anwesenheit des 35S-as-1-Elements im NtPR1a-Promotor führt zur konstitutiven Aktivität in den Wurzelspitzen. Im Blattgewebe ist aber weiterhin eine SA-abhängige Aktivierung nachzuweisen.-
Im Hefe-Einhybridsystem zeigen sich bei der Interaktion von TGA-Faktoren mit as-1 und den as-1-ähnlichen Elementen des AtPR1-, NtPR1a- und N2-Promotors bei der Qualität der Bindung nur geringe Unterschiede, während deutliche Differenzen bei der quantitativen Bindungsstärke auftreten. Die Mutation der as-1-ähnlichen Elemente im NtPR1a- und N2-Promotor führt dabei zum Verlust der Bindung. In der N1-Promotorregion von -436 bis -399 ist eine TGA-Bindestelle vorhanden. Die Einführung von Mutationen in die enthaltene TGATG-Wiederholung führt zum vollständigen Verlust der Bindung von TGA-Transkriptionsfaktoren.
Der angrenzende Promotorkontext kann sowohl einen positiven als auch einen negativen Einfluss auf die Bindung der TGA-Faktoren ausüben. Im Fall des N1-Promotors führt die Anwesenheit der umgebenden Promotorregion zu einer verstärkten Bindungsaffinität. Im Gegensatz dazu zeigt der zusätzliche NtPR1a-Promotorkontext eine deutliche Reprimierung der Anlagerung von TGA-Faktoren an das as-1-ähnliche Element.
NIMIN-Proteine und TGA-Faktoren konkurrieren im Hefe-Dreihybridsystem trotz unabhängiger Bindestellen um die Bindung an AtNPR1. Die Anwesenheit von N1 und N3 behindert dabei die Interaktion von TGA-Faktoren mit NPR1, während eine gleichzeitige Bindung von N2 und TGA-Faktor ohne Einschränkungen möglich ist. Eine Bindung von N1 bzw. N2 gleichzeitig mit N3 am C- und N-Terminus von NPR1 führt ebenfalls zu einer gegenseitigen Behinderung und lässt auf eine räumliche Faltung von AtNPR1 schließen, bei der sich N- und C-Terminus nahe kommen.
Systemic acquired resistance (SAR) is an important defense mechanism of plants against a broad range of pathogens. NPR1 acts as a central regulator controlling the salicylic acid (SA)-dependent formation of SAR through interaction with TGA transcription factors leading to the induction of ?pathogenesis-related? (PR) proteins. The SA-activated expression of the PR1 genes in Arabidopsis thaliana (At) and Nicotiana tabacum (Nt) depends on cis-acting as-1-like elements with a TGACG sequence. This dissertation studies the functional relevance of NIMIN proteins and SA-dependent PR gene induction using the analysis of gene regulation. Arabidopsis has four NIMIN-genes ? N1, N2, N3 and N1b which interact independently of TGA transcription factors with NPR1. N1 and N2 have a common interaction motif and bind to the C-terminus of AtNPR1, whereas N3 binds to the N-terminus of AtNPR1. The binding site for the TGA transcription factors is located relatively central in the AtNPR1 protein. The analysis of the NIMIN gene expression in the SA-dependent signaling pathway of SAR as well as their possible involvement in the Jasmonic (JA) signaling network ought to offer new aspects for understanding the regulation of plant pathogen defense. The relevance of different as-1-like elements was studied by establishing a yeast one-hybrid system.
N1b is likely to be an inactive pseudogene. Neither could transcripts be detected in untreated, SA- or JA-treated Arabidopsis plants nor was the construct N1b[GUS] with the 1135 bp 5?-region able to induce reporter gene expression in transgenic tobacco plants. Expression of N3 occurs constitutively at low levels and independently of NPR1. Treatment with SA or JA does not lead to induction of N3. Likewise, the N3 promoter is not affected by treatment with SA, JA, TMV and phytohormones. Reporter gene expression of the N3 promoter occurs constitutively in transgenic tobacco seedlings.
In contrast, N1 and N2 are clearly SA-induced. After SA induction, the expression of N2 is immediate and long-lasting and regulated independently of NPR1. N1 is expressed transiently at a later point in time and is NPR1-dependent. The expression of both, N1 and N2, clearly occurs before PR1 gene expression. The analysis of GUS-reporter gene constructs confirms the early SA-dependent induction of the N1 and N2 promoters before activation of the NtPR1a promoter. Similar to the PR1a promoter, both NIMIN promoters can be induced by thiamine-HCl and show an inhibitory effect of the JA signaling network on the strength of reporter gene expression during simultaneous treatment with SA and JA. At the histological level, the N1 and N2 promoters display SA-dependent activation in leaf and root tissue of young tobacco seedlings. This activity clearly differs from the N3 promoter.
The N2 promoter ? just like the AtPR1 and NtPR1a promoters ? contains an as-1-like element with a tandem repeat of TGACG, responsible for the SA sensitivity of the promoter. However the N2 as-1-like element structurally differs from the as-1-like elements in the PR1 promoters.
In the N1 promoter a SA-responsive element was located in the region of -436 to -402 with respect to the translation starting point of the N1 gene. However, mutation of a TGATG repeat within this region did not result in a loss of promoter activity.
Analysis of chimeric promoter constructs with foreign as-1-like elements showed that the different expression kinetics of PR1 and NIMIN genes are not encoded by the genetic information of the respective as-1-like elements. On the contrary, the as-1-like cis-acting elements affect the promoters? tissue specificity. Due to the integration of the N2-as-1-like element, the NtPR1a promoter, which is solely active in leaf tissue, adopts the typical NIMIN activity in root tissue. The presence of the 35S-as-1 element in the NtPR1a promoter leads to constitutional activation in root tissue. However, the activation in leaf tissue is still SA-dependent.
In the yeast one-hybrid system, the interaction of TGA factors with as-1 and the as-1-like elements of the AtPR1, NtPR1a and N2 promoters shows only small differences in binding quality, whereas considerable differences can be detected in quantitative binding strength. Mutation of the as-1-like elements in the NtPR1a and N2 promoters results in the loss of TGA factor binding. The N1 promoter region from -436 to -399 contains a TGA binding site. Mutation of the contained TGATG repeat leads to a total loss of binding of TGA transcription factors.
The neighbouring promoter context can exert both positive and negative influence on TGA factor binding. In case of the N1 promoter, the presence of adjacent promoter regions results in increased binding affinity of TGA factors. In contrast, additional NtPR1a promoter context shows a considerable reduction of TGA factor binding to as-1-like elements.
Despite independent binding sites, NIMIN proteins and TGA transcription factors compete for binding of AtNPR1 in the yeast three-hybrid system. The presence of N1 and N3 thereby impedes interaction of TGA factors with NPR1, whereas simultaneous binding of N2 and TGA factor is possible without any restrictions. Binding of N1 or N2 simultaneously with N3 at the C- and N-termini of NPR1 also results in reciprocal interference suggesting a spatial folding of NPR1 where the N- and C-termini lie closely together.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Artur
Pfitzner
Prof. Dr.
2009-11-19
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-4195
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/419/
oai:opus.uni-hohenheim.de:426
2010-03-15T09:07:10Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Molecular characterization of the interaction of lactobacilli with food environments and enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7
Molekulare Charakterisierung der Interaktion von Laktobazillen mit Lebensmitteln und enterohämorrhagischen Escherichia coli O157:H7
Eric
Hüfner
570
Lactobacillus reuteri , Lactobacillus sake , Lactobacillus , Differentielle Genexpression , Genexpression , Lebensmittelmikrobiologie
Quorum Sensing Quorum Sensing
The first part of this thesis focuses on the gene expression of Lactobacillus sakei and Lactobacillus reuteri in food fermentation using in vivo expression technology (IVET) and DNA microarray hybridization analysis, respectively. Both technologies allow the identification of regulated genes in a specific environment, which are likely to contribute to the ecological performance of the organism. Thus, the obtained results provide a basis for the development of new strategies to improve the fermentation process, as it was demonstrated by the development of an efficient method for the improvement of sausage fermentation using L. sakei.
To obtain hygienically safe products, the function of starter cultures mostly relies on the ability to acidify and produce other antimicrobial principles. However, it was recently demonstrated that the interaction with pathogens also can take place on another level, apart from killing or growth inhibition. Lactobacilli have been shown to influence the virulence gene expression of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) via the bacterial communication system termed quorum sensing. The second part of the thesis explores the impact of quorum sensing between Lactobacillus reuteri strains and EHEC O157:H7 on EHEC virulence gene expression. By using a green fluorescent protein reporter gene assay, it was demonstrated for the first time that the transcription of the ler virulence regulator gene is significantly reduced by secreted substances of L. reuteri in a strain- and quorum sensing-dependent manner.
Der erste Teil dieser Dissertation beschäftigt sich mit der Untersuchung der Genexpression von Lactobacillus sakei und Lactobacillus reuteri während der Lebensmittelfermentation mittels in vivo expression technology (IVET) bzw. DNA-Microarray-Analyse. Beide Technologien erlauben die Identifizierung von Genen, die in einem bestimmten Habitat regulierte Expression aufweisen, und aus diesem Grund wahrscheinlich zum ökologischen Erfolg des Organismus beitragen. Die erhaltenen Ergebnisse bilden die Grundlage zur Entwicklung neuer Strategien der Verbesserung von Fermentationsprozessen. Dieses Potential wurde durch die Entwicklung einer effizienten Methode zur Verbesserung der Rohwurstfermentation mit Hilfe von Lactobacillus sakei demonstriert.
Die Herstellung hygienisch sicherer fermentierter Lebensmittel ist von der Fähigkeit der eingesetzten Starterorganismen abhängig, Säuren und andere antimikrobiell wirksamen Stoffe zu bilden. Die Interaktion mit pathogenen Mikroorganismen kann allerdings auch auf einer anderen Ebene als Wachstumsinhibition oder Abtötung stattfinden. Laktobazillen können die Virulenzgen-Expression von enterohämorrhagischen Escherichia coli (EHEC) durch bakterielle Kommunikation, genannt Quorum Sensing, beeinflussen. Der zweite Teil dieser Dissertation untersucht den Einfluss von Quorum Sensing zwischen Lactobacillus reuteri und EHEC O157:H7 auf die Virulenzgen-Expression von EHEC. Durch den Einsatz eines Green-Fluorescent-Protein-Reportergenassay konnte erstmals eine signifikante Repression der ler-Virulenzgen-Expression durch sekretierte Substanzen von Lactobacillus reuteri gezeigt werden, die sowohl Quorum Sensing- als auch stammabhängig ist.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Christian
Hertel
Priv. Doz. Dr.
2009-12-04
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-4268
application/pdf
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/426/
oai:opus.uni-hohenheim.de:488
2010-08-30T14:45:40Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Glucocorticoid-induziertes Wachstum von Tumorzellen : systematische Quantifizierung, Signalmechanismen und Inhibition
Glucocorticoid-induced growth of tumour cells : systematic quantification, signalling mechanisms and inhibition
Sibylle
Gündisch
570
Glucocorticosteroide , Tumorzelle , Proliferation
Signalmechanismen , p38-MAPK , Akt , Inhibition glucocorticoids , adverse drug effects , tumor cell proliferation , signalling mechanisms , kinase inhibitors
Glucocorticoide (GC) wie Dexamethason (Dex) werden in der Tumortherapie häufig
eingesetzt, zum einen als Zytostatika zur Behandlung hämatopoetischer Tumoren
und zum anderen als Adjuvantien zur Reduktion von Nebenwirkungen in der
Behandlung solider Tumoren. In den letzten Jahren wurde jedoch gezeigt, dass GC
die Wirkung von Zytostatika auf Zellen solider Tumore abschwächen können. Durch
Vorarbeiten in unserer Arbeitsgruppe kam der Verdacht auf, dass GC in der Lage
sind, Proliferation von Tumorzellen zu induzieren.
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die GC-induzierte Proliferation von
Tumorzellen systematisch untersucht. Das beschleunigte Tumorzellwachstum wurde
mittels repetitiver Mikroskopie, Impedanzanalyse, Bestimmung der DNASyntheserate, der enzymatischen Aktivität sowie der absoluten Zellzahl validiert. Eine Quantifizierung ergab, dass 6 von 10 Zelllinien verschiedenster solider Tumoren mit Proliferation auf GC reagierten. Darüber hinaus konnten die in vitro erhobenen pro-proliferativen Effekte der GC durch einen Tierversuch mit einer Lungenkarzinomzelllinie ebenfalls in vivo bestätigt werden. Des Weiteren wurden 139 primäre Proben von Kindern mit akuter Leukämie getestet und bei 15% der Proben ein Überlebensvorteil der Tumorzellen durch GC gemessen; eine Probe zeigte sogar GC-induzierte Proliferation. Demzufolge konnte der anti-apoptotische und pro-proliferative Effekt von GC nicht nur auf etablierten Zelllinien solider Tumore, sondern auch auf primären hämatopoetischen Tumorzellen nachgewiesen werden.
Knockdown-Studien in Zellen solider Tumoren zeigten eine wichtige Rolle des
Glucocorticoidrezeptors für die GC-induzierte Proliferation, welche des Weiteren
durch die beiden Proteinkinasen Akt und p38-MAPK vermittelt wurde. GC-induzierte
Proliferation konnte durch Apoptoseinduktion verhindert werden, die einerseits durch klinisch einsetzbare Substanzen, wie beispielsweise Vincristin herbeigeführt wurde, andererseits durch induzierbare Expression des pro-apoptotischen Moleküls Caspase-3.
Zusammenfassend charakterisiert die vorliegende Arbeit GC-induzierte Proliferation von Tumorzellen als neue, Tumorzell-gerichtete Nebenwirkung von GC. Die Daten sprechen für einen zurückhaltenden Einsatz von GC während der
Tumortherapie sowie für die Durchführung weiterführender präklinischer und
klinischer Studien, die einen effektiveren und sichereren Einsatz von GC während
der Tumortherapie aufzeigen.
Glucocorticoids (GCs) like Dexamethasone (Dex) are widely used in cancer patients, as cytotoxic drugs in hematopoetic tumors or adjuvants in solid tumors to reduce severe side effects. Nevertheless, GCs are accused to reduce anti-cancer treatment efficiency. Due to preliminary works in our research group the suspicion arose that GCs are able to induce proliferation of tumor cells.
The present work provides the first systematic quantification of the proproliferative effects of GCs on tumor cells. Enhanced tumor cell growth was validated by repetitive microscopy, impedance analysis, investigation of DNA synthesis rate, enzymatic activity as well as absolute cell number. It could be proven that 6 out of 10 cell lines from solid tumors showed enhanced proliferation after stimulation with Dex, whereas this phenotype was not limited to one tumour entity or a common origin. In vivo, Dex significantly promoted tumor cell growth in a preclinical mouse model with a lung carcinoma cell line. Furthermore the effect of GCs was detected on 139 primary, patient-derived acute childhood leukemia cells. In 15% GCs were able to increase the in vitro survival of the tumor cells and one sample showed even GC-induced proliferation. Accordingly the anti-apoptotic and pro-proliferative effects of GCs could be proven not only on established solid tumor cell lines but also on primary hematopoetic tumor cells.
Knockdown studies in cells of solid tumors showed that GC-induced proliferation was mediated by the glucocorticoid receptor and was further transmitted by the proteinkinases Akt and p38-MAPK. GC-induced proliferation could be prevented by induction of apoptosis which was caused either by clinically applicable substances, as for example Vincristine, or by inducible expression of the pro-apoptotic molecule Caspase-3.
To sum up, the present work identified GC-induced proliferation of tumor cells as a new, tumor cell directed side effect of GCs. Of direct translational relevance, our data argue towards a restricted use of GCs during anti-cancer therapy as well as the need for preclinical and clinical studies which demonstrate a more effective and safer application of GCs during anti-cancer therapy.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Irmela
Jeremias
Priv. Doz. Dr. med.
2010-06-16
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-4888
application/pdf
ger
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/488/
oai:opus.uni-hohenheim.de:489
2010-08-31T07:44:04Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Vakzinierungsstrategien gegen eine Echinococcus multilocularis-Infektion zur Charakterisierung protektiver Immunantworten
Vaccination strategies against an Echinococcus multilocularis infection to characterize protective immune responses
Torsten
Wassermann
570
Fuchsbandwurm , Impfstoff , Antigen , Salmonella typhimurium , Immunreaktion
EM95 , EMGAPDH Echinococcus multilocularis , immunization , Salmonella typhimurium , EM95 , EMGAPDH
Die Larvalstadien von Echinococcus multilocularis verursachen beim Menschen das Krankheitsbild der alveolären Echinokokkose (AE), welches laut WHO die gefährlichste parasiten-induzierte Zoonose in Mitteleuropa darstellt. Weitere Erkenntnisse über Infektionsverlauf und mögliche protektive Mechanismen gegen eine Infektion mit diesem Zestoden sind daher von großem Wert.
In beinahe allen vorangegangenen Infektionsstudien mit Echinococcus multilocularis im Zwischenwirt wurde die Methode der sekundäre Echinokokkose als Infektionsweg gewählt. Da diese nicht dem natürlichen Verlauf entspricht, können resultierende Immunantworten, insbesondere in der Frühphase der Infektion, nicht ohne Einschränkungen auf die einer primären alveolären Echinokokkose übertragen werden. In der vorliegenden Arbeit die Methode der primären AE durchgeführt. Die Antigene EM95 und EMGAPDH wurden einerseits in einer konservativen Vakzinierungsstrategie als aufgereinigte Proteine in Verbindung mit einem Adjuvans subkutan appliziert, andererseits wurde ein System entwickelt, in welchem diese Antigene von Salmonellen exprimiert und im Falle von EM95 durch das HämolysinA-Transportsystems erfolgreich exportiert werden.
In zwei unabhängigen Immunisierungsstudien, in welchen EMGAPDH mit Saponin als Adjuvans subkutan appliziert wurde, konnte eine signifikante Reduktion der Zystenbildung erzielt werden. Die Parasitenbürde verringerte sich gegenüber den infizierten Kontrolltieren um 76,4% im ersten Versuch und 86,1% im zweiten Versuch.
Durch die subkutane Immunisierung mit dem Antigen EM95 konnte die Parasitenlast in zwei Versuchen um 96,9% bzw. 98,4% gegenüber den infizierten Kontrolltieren verringert werden. Ein Einfluss der sekretorischer Einheit und der Transmembrandomain von EM95 kann aufgrund der hier durchgeführten Studien ausgeschlossen werden.
Die subkutanen Immunisierungen mit den rekombinanten Antigenen EM95 und EMGAPDH induzierten einen hohen Antikörpertiter gegen diese Proteine, welche vorwiegend auf den IgG-Subklassen IgG1 und IgG2a beruhten. E. multilocularis - Gesamtantigen ? spezifische Antikörper konnten nach 4wöchiger Infektionsdauer weder bei geschützten Tieren noch den infizierten Kontrollgruppen festgestellt werden.
Aufgrund der erhöhten Ausschüttung von IFNγ nach Immunisierung mit den rekombinanten Antigenen EM95 und EMGAPDH scheint eine Beteiligung von zytotoxischen T-Zellen und NK-Zellen an den protektiven Immunmechanismen gegen eine Infektion mit E. multilocularis höchst wahrscheinlich. Werden die hier untersuchten immunologischen Parameter der vakzinierten Tiere zusammengefasst, beruhen die protektiven Mechanismen auf eine Th1-geprägte Immunantwort. Eine Beteiligung von Th2-Komponenten ist jedoch denkbar, da zumindest in einem Teil der Studien eine Detektion von IL-10 erfolgte und eine ausgeprägte IgG1 Antikörper-Bildung nach Immunisierung stattfand.
Durch den Einsatz des Plasmides pVDL9.3 gelang es in dieser Arbeit erstmalig das Metazooen-Protein EM95 des Zestoden Echinococcus multilocularis erfolgreich mittels des HämolysinA-Systems aus dem Vektor Salmonella typhimurium zu exportieren.
Durch die Immunisierung mit ZpVDL9.3EM95 konnte in einer Studie eine 78%ige Reduktion der Metazestodenlast gegenüber der infizierten Kontrollgruppe erzielt werden. Mäuse, welche mit dem EMGAPDH exprimierenden Salmonellen-Stamm ZpVDL9.3EMGAPDH immunisiert wurden, bildeten 73% weniger Zysten aus. In einem weiteren Versuch, in dem zu dem Salmonella-Vektor ZpVDL9.3EMGAPDH eine weitere subkutane Immunisierung mit EMGAPDH erfolgte, erzielte eine Abnahme der Metazestodenbildung um 87%. Eine Kontroll-Immunisierung mit S. typhimurium führte ebenfalls zu einer signifikanten Reduktion der Metazestodenlast um 68%. Eine Bildung von Antikörpern gegen die E. multilocularis ? Antigene EM95 und EMGAPDH konnte nach Immunisierung mit den Salmonella-Vektoren nicht nachgewiesen werden. Die Antikörperbildung gegen S. typhimurium dagegen war deutlich ausgeprägt.
Eine subkutane Immunisierung post infectionem mit EM95 und Saponin als Adjuvans zu den Zeitpunkten 4dpi, 7dpi, 24dpi und 60dpi führte weder zu einer Reduktion der Metazestodenlast, noch wurde eine Veränderung in der Größe der einzelnen Zysten festgestellt.
Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse hinsichtlich der schützenden Eigenschaften von EM95 und EMGAPDH unter Anwendung des natürlichen Infektionsmodus erhöhen das Verständnis protektiver Immunmechanismen gegen eine Echinococcus multilocularis Infektion. Die Konstruktion eines Immunisierungssystems in Form einer Salmonella typhimurium ? Lebendvakzine, welche Metazoen-Antigene exportiert, eröffnet neue Möglichkeiten für zukünftige Immunisierungenansätze gegen diverse Parasiten.
The larval stages of Echinococcus multilocularis are the causative agents of the human alveolar echinococcosis (AE), which is according to the WHO the most important parasite-induced zoonosis in middle Europe. Additional knowledge about the infection process and possible protective mechanisms against an infection with this cestode would be of great value.
Almost all previous studies about Echinococcus multilocularis infections in the intermediate host were carried out by using the secondary echinococcosis as route of infection. This route of infection doesn?t correspond to the natural route, the oral uptake of Echinococcus eggs resulting in a primary alveolar echinococcosis. Thereby the resulting immune responses of the secondary AE cannot be converted without reservations to the primary AE, especially in the early stages of the infection. On that account the primary AE was carried out in this study.
On the one hand a conservative vaccination with purified antigen EM95 and EMGAPDH in combination with an adjuvant was subcutaneous administered and on the other hand a system was developed in which the antigen EM95 were expressed by salmonellae and exported via the hemolysinA-transport system.
A significant reduction of the formation of cysts could be achieved in two separate immunisation trials with EMGAPDH combined with the adjuvant Saponin which was administered subcutaneously. The manifestation of cysts was reduced by 76.4 % in the first and 86.1 % in the second trial compared to the infected control group.
The subcutaneous immunisation with the antigen EM95 reduced the manifestation of cysts even by 96.9 % and 98.4 % respectively. Sixty percentages of the animals showed a complete protection against an infection with E. multilocularis in both trials. Based of the experiments which were carried out during this study, the influence of the secretory unit or the transmembrane domain of EM95 can be excluded.
The subcutaneous immunisation with the recombinant antigens EM95 and EMGAPDH induced a high antibody titre against those proteins, which based predominantly on the IgG-subclasses IgG1 and IgG2a. The detection of specific antibodies against E. multilocularis crude antigen after duration of infection of 4 weeks was neither in protected animals nor in the infected control group possible. The vaccination trials with the recombinant antigens EM95 and EMGAPDH lead us to the conclusion that the murine immune system was stimulated to detect suitable target epitopes of the oncosphere surface and to destroy these oncospheres by classical complement activation.
It seems very probable that cytotoxic T-cells and natural killer cells are involved in the protective immune mechanisms against an E. multilocularis infection owing to the finding of an increased release of IFNγ as a result of an immunisation with the recombinant antigens EM95 and EMGAPDH. Summarizing the investigated immunological parameters, the protective mechanisms are based on a Th1 associated immune response. Nevertheless, an involvement of Th2 components is conceivable due to the fact that at least in parts of the study the cytokine IL-10 and a distinct IgG1 antibody response could be detected past the immunisation.
By the use of the plasmid pVDL9.3 we succeeded for the first time to manipulate Salmonella typhimurium to export the metazoan protein EM95 via the hemolysinA-system.
The immunisation with ZpVDL9.3EM95 resulted in a reduction of manifested cysts by 78 % compared to the infected control group. Mice immunized with ZpVDL9.3EMGAPDH, where an export was not accomplished, showed a decrease in cysts manifestation by 73 %. The amount of cysts could be further reduced up to 87 % by the combined immunisation with the Salmonella vector ZpVDL9.3EMGAPDH and a subcutaneous application of EMGAPDH. A significant reduction of cysts (68 %) could be also observed by the control immunisation with plain S. typhimurium. Antibodies against the E. multilocularis antigens EM95 and EMGAPDH could not be detected after the immunisation with the Salmonella vectors. However, the antibody formation against S. typhimurium was strongly developed.
A subcutaneous post infection immunisation trial with EM95 in combination with the adjuvant Saponin at the time of 4dpi, 7dpi, 24dpi and 60dpi led neither to a reduction of the amount of cysts nor to a change in size of the developed cysts.
The gained insights of this study into the protective potential of EM95 and EMGAPDH on the basis of a natural infection rout expand the knowledge and understanding about the protective immune mechanisms against an Echinococcus multilocularis infection. The development of an immunisation system in form of a Salmonella typhimurium live vaccine, with the ability of exporting metazoan antigens, opens up new possibilities of immunisation strategies against diverse parasites in future.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Ute
Mackenstedt
Prof. Dr.
2010-07-30
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-4894
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_mit_pod.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/489/
oai:opus.uni-hohenheim.de:492
2010-09-09T07:34:15Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Exzitatorische Pharmakologie der retinalen Spreading Depression
Excitatory pharmacology of the retinal spreading depression
Michaela
Sieber
570
Spreading depression , Dopamin , Serotonin , Noradrenalin , Netzhaut , Acetylcholin , Zentralnervensystem
exzitatorisch , Retina Spreading Depression , CNS
Das Phänomen der Spreading Depression (SD) ist eine sich wellenförmig ausbreitende Unterdrückung neuronaler Aktivität, die in der grauen Substanz des Zentralen Nervensystems auftritt. Dies resultiert aus einer massiven Ionenumverteilung an der Zellmembran, bei der Kalium-Ionen aus der Zelle hinausströmen und Natrium-, Chlorid- und Calcium-Ionen in die Zelle hineinströmen. Dabei kommt es zu einer langsamen negativen Potentialverschiebung von bis zu 30mV. Das Phänomen der Spreading Depression lässt sich auch in der Retina, einem Teil des ZNS, hervorrufen, und kann sehr gut mit dem bloßen Auge beobachtet werden. Die Wirkung exzitatorischer Pharmaka auf neuronales Gewebe am Modell der retinalen Spreading Depression ist Thema der vorliegenden Arbeit.
Durch die Applikation der unterschiedlichen exzitatorischen Substanzen lässt sich eine Abnahme der Ausbreitungsgeschwindigkeit sowie eine Reduktion der Leitfähigkeit der Membranen feststellen. Dies wird im Falle von Nikotin vermutlich durch die Desensitisierung der nikotinischen Acetylcholinrezeptoren verursacht. Bei Koffein, Kokain, Amphetamin und Methylphenidat liegt die Wirkung vermutlich in der, durch geöffnete Kationenkanäle begründeten, Hyperpolarisation des Gewebes. Die Latenz, ein Parameter für die Erregbarkeit des Gewebes, nimmt bei allen applizierten Substanzen zu. Dies ist vermutlich ebenso in der Desensitisierung der nACh-Rezeptoren bzw. der Hyperpolarisation des Gewebes begründet. Für alle Substanzen konnte eine neuroprotektive Wirkung gegen den, durch NMDA-Rezeptoren vermittelten, exzitotoxischen Zelltod nachgewiesen werden. Bei Nikotin geht man von einer Beteiligung der α7- und α4β2-nACH-Rezeptoren aus, jedoch ist der zugrunde liegende Mechanismus noch nicht aufgeklärt. Eine mögliche Erklärung ist jedoch in der reduzierten Erregbarkeit des neuronalen Gewebes durch die Desensitierung der nACh-Rezeptoren zu finden. Bei den übrigen untersuchten Substanzen liegt die Annahme einer neuroprotektiven Wirkung durch die im synaptischen Spalt verbleibenden Transmitter nahe. Die daraus resultierende Hyperpolarisation hat eine geringere Erregbarkeit des neuronalen Gewebes zur Folge und verhindert somit sehr wahrscheinlich eine Übererregung des Gewebes.
The phenomenon of Spreading Depression (SD) is a suppression of neuronal activity, propagating wave-like in the grey matter. This results from a massive ion translocation where potassium ions pour into the cell and sodium-, chlorideand calcium ions pour out of the cell. At the same time there is also a slow negative potential shift up to 30mV. Spreading Depression also occurs in the retina, a part of the central nervous system and can easily be observed there with the naked eye. This dissertation describes the effects of excitatory pharmaceuticals on neuronal tissue, using retinal spreading depression as a model system.
By applying different excitatory substances, a reduction of the velocity and an inhibitory effect on the conductivity of the membranes can be observed. In the case of nicotine this may be due to the desensitization of the nicotinic AChreceptors. For caffeine, cocaine, amphetamine and metylphenidate this effect may derive from the hyperpolarisation of the tissue through open cation channels. The latency, a parameter for the excitability of the tissue, increases with the application of any of the investigated substances. This is also caused by the desensitization of the nicotinic ACh-receptors or the hyperpolarisation of the tissue, respectively. A neuroprotective effect reducing excitotoxic cell death induced by activation of NMDA-receptors was successfully verified for all substances. In the case of nicotine, the α7- and α4β2-nACh-receptors are assumed to be involved. The basic mechanism however is still unknown. A possible explanation could be the reduced excitability of the tissue through desensitization of the nACh-receptors. In the case of the remaining substances, the abidance of transmitters in the synaptic cleft suggests a neuroprotective effect through hyperpolarisation. The resulting hyperpolarisation leads to a reduced excitability of the neuronal tissue and most likely prevents over-excitation.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Wolfgang
Hanke
Prof. Dr.
2010-06-09
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-4927
application/pdf
ger
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/492/
oai:opus.uni-hohenheim.de:497
2010-09-15T12:59:04Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Herstellung und Charakterisierung einer rekombinanten, sequenzspezifischen Protease zur Generierung bioaktiver Peptide
Production and characterisation of a recombinant, sequence specific protease to generate bioactive peptides
Thomas
Hug
570
Peptide
Lysyl-Endopeptidase , Endoprotease LysC , Lysobacter enzymogenes , Caseinhydrolyse , bioaktive Peptide lysyl-endopeptidase , endoprotease lysC , Lysobacter enzymogenes , casein hydrolysis , bioactive peptides
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine sequenzspezifische, mikrobielle Protease herzustellen, biochemisch zu charakterisieren und mittels dieses Enzyms aus Lebensmittelprotein hydrolytisch bioaktive Peptide zu generieren. Um die Serin-Protease PRT1 aus Xanthomonas campestris pv. campestris bezüglich ihrer Substratspezifität zu untersuchen, wurde dieser Stamm im Schüttelkolben kultiviert. Nach Dialyse des Kulturüberstandes und Zugabe von 1,10-Phenantrolin zur Inaktivierung der Metalloprotease PRT2 konnte eine Enzymaktivität von 0,34 nkat Casein/mL detektiert werden. Der Umsatz verschiedener chromogener Peptidsubstrate zeigte, dass PRT1 keine eindeutige Substratspezifität aufweist. Die Lysyl-Endopeptidase LysC aus Lysobacter enzymogenes ssp. enzymogenes wurde durch Kultivierung des Wildstamms (ATCC 27796) gewonnen. Im Bioreaktor(1 L Arbeitsvolumen) konnte nach 45 h eine maximale Protease-Aktivität von 0,084 nkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/mL im Kulturüberstand nachgewiesen werden. Das LysCGen wurde mittels PCR aus genomischer DNA amplifiziert und in den E. coli Expressionsvektor pET20b(+) kloniert. Die Expression in E. coli BL21(DE3) führte jedoch zu keiner nachweisbaren Bildung von rekombinanter Protease. Daher wurde ein bereits in der Literatur beschriebenes, synthetisches Genkonstrukt mit verkürzter N-terminaler Prosequenz (MGSK) und an E. coli angepasster ?Codon Usage? für die heterologe Expression untersucht. Die Bioreaktor-Kultivierung (5 L Arbeitsvolumen) von E. coli BL21(DE3) pET20b-MGSK-LysC führte zu rekombinanter LysC, welche in Form von ?Inclusion Bodies? in den Zellen gebildet wurde. Die Solubilisierung der ?Inclusion Bodies? und anschließende Renaturierung des Enzyms mit L-Arginin als unspezifischer Faltungshilfe ergab eine maximale Proteaseaktivität von 0,06 nkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/L Kultur 5 h nach IPTG-Induktion. Um die Ausbeute an rekombinanter Proteaseaktivität steigern zu können, wurde der Einfluss der beiden LysC-Propeptide auf die in vitro Renaturierung der Protease untersucht. Hierfür wurden die Propeptid-DNA-Sequenzen aufgeklärt, kloniert und in E.coli heterolog exprimiert. Die Zugabe von C-terminalem und N-terminalem Propeptid zur LysC-Renaturierung führte zu einer bis zu 27fachen (1,56 Îkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/L Kultur) Steigerung der LysC-Aktivität bezogen auf die Renaturierung mit L-Arginin. Als alternatives ?Food-grade? Expressionssystem wurde das in der Literatur etablierte Expressionssytem von Lactobacillus plantarum NC8 bzw. L. sakei Lb790 und dem E. coli-Lactobacillus Shuttle-Vektor pSIP409 eingesetzt. Jedoch konnte weder bei der Schüttelkolben-Kultivierung von L. plantarum NC8 pSIP409-MGSK-LysC noch von L. sakei Lb790 pSIP409-MGSK-LysC rekombinante Lysyl-Endopeptidase nachgewiesen werden. Da als möglicher Grund hierfür die unterschiedliche ?Codon Usage? von E. coli und Lactobacillus angenommen wurde, wurden Expressions-Experimente mit punktmutierten Varianten des beta-Galactosidasegens aus Kluyveromyces lactis durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass der Austausch des Serin-Codons tca bzw. agt gegen tcc einen deutlichen Einfluss auf die resultierende Enzymaktivität hatte. So führte der dreifache Codon-Austausch zu einer Verringerung der beta-Galactosidase-Aktivität um 38 %. Die Charakterisierung der rekombinanten Lysyl-Endopeptidase LysC bestätigte die hohe Substratspezifität für Lysinreste an P1-Position. Das pH- bzw. Temperatur-Optimum lag bei 8,5 bzw. 45°C. Bei 4°C und pH 9 war das Enzym für mindestens 20,5 h stabil, während bei 45°C nach 1 h nur noch 40 % Restaktivität gemessen werden konnten. Eine inhibierende Wirkung auf LysC zeigten Ba2+, NH4+ und PMSF. Die Hydrolyse von bovinem Casein mit LysC generierte die ACE-inhibierenden Peptide EMPFPK, FALPQYLK, NMAINPSK und ALNEINQFYQK sowie das antioxidativ wirkende VLPVPQK, die alle eindeutig mittels LC-ESI-MS/MS detektiert werden konnten. Über entsprechende in vitro Assays wurden die Radikalfänger-Aktivität (IC50 = 4,85 Îg/mL), die Lipoxygenase-Inhibierung (IC50 = 23,6 Îg/mL) sowie die ACE-Inhibierung (IC50 = 2,78 Îg/mL) des Casein-Hydrolysat quantifiziert.
The aim of the present thesis was the production and biochemical characterization of a sequence specific microbial protease. This enzyme should be applied in food protein hydrolyzation in order to generate bioactive peptides. To determine the substrate specificity of serine protease PRT1 from Xanthomonas campestris pv. campestris this strain was cultivated in a shaking flusk. After dialysis of the culture broth and addition of 1,10-phenantroline for metalloprotease PRT2 inactivation an enzyme activity of 0,34 nkat Caseine/mL was detected. The conversion of several chromogenic peptide substrates revealed that PRT1 does not offer a clear substrate specificity. The lysyl endopeptidase LysC from Lysobacter enzymogenes ssp. enzymogenes was obtained by cultivation of the wild type strain (ATCC 27796). In a bioreactor (1 L scale) a maximum protease activity of 0,084 nkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/mL in the culture broth was detected after 45 h. The LysC gene was amplified by PCR using genomic template DNA and was cloned into the E. coli expression vector pET20b(+), leading to no detectable recombinant protease when expressed in E. coli BL21(DE3). Thus for the heterologous expression a synthetic gene construct was applied which was formerly described in literature. It contained a short N-terminal pro-sequence (MGSK) and a codon usage adapted to E. coli. The bioreactor cultivation (5 L scale) of E. coli BL21(DE3) pET20b-MGSK-LysC led to LysC inclusion bodies. The solubilization of the inclusion bodies and the following enzyme renaturation using L-arginine as an unspecific folding additive resulted in a maximum protease activity of 0,06 nkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/L Culture 5h after IPTG induction. To increase the yield of recombinant protease activity the influence of the LysC propeptides on the in vitro renaturation of the protease was investigated. For this purpose both pro-peptide DNAs were sequenced, cloned and heterologously expressed in E. coli BL21(DE3). The addition of C-terminal and N-terminal propeptide to the LysC renaturation led to a maximum of 27fold (1.56 Îkat Tos-Gly-Pro-Lys-pNA/L Culture) LysC activity increasion compared to the L-arginine renaturation. As an alternative food-grade expression system the in the literature already established system of Lactobacillus plantarum NC8, L. sakei Lb790 and the E. coli-Lactobacillus shuttle vector pSIP409 was tested. However, the shaking flusk cultivations of neither L. plantarum NC8 pSIP409-MGSK-LysC nor L. sakei Lb790 pSIP409-MGSK-LysC led to detectable recombinant lysyl endopeptidase. As a possible reason therefor the different codon usage of E. coli and Lactobacillus was assumed. So expression experiments were performed using point mutated variants of the beta-galctosidase gene from Kluyveromyces lactis. It could be shown that the exchange of the serine codons tca/agt and tcc had a significant effect on the resulting enzyme activity. The exchange of three codons led to a decreation of beta-galactosidase activity of 38 %. The characterization of the recombinant lysyl endopeptidase LysC confirmed the high substrate specificity for lysine residues at P1 position. The pH and temperature optimum was 8.5 and 45°C, respectively. At 4°C and pH 9 the enzyme was stable for at least 20.5 h, whereas at 45°C only 40 % residual activity were detected after 1 h. An inhibiting effect on LysC was demonstrated for Ba2+, NH+ and PMSF. Hydrolysis of bovine caseine by LysC for generated the ACE inhibiting peptides EMPFPK, FALPQYLK, NMAINPSK and ALNEINQFYQK as well as the antioxidative VLPVPQK, which all were unambiguously identified by LC-ESI-MS/MS. Performing appropriate in vitro assays, the radical scavenging acticvity (IC50 = 4,85 Îg/mL), lipoxygenase inhibition (IC50 = 23,6 Îg/mL) and ACE inhibition (IC50 = 2,78 Îg/mL) of the caseine hydrolysate were quantified.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Lutz
Fischer
Prof. Dr.
2010-05-04
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-4977
application/pdf
ger
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/497/
oai:opus.uni-hohenheim.de:500
2010-10-13T10:00:13Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Patch clamp experiments with human neuron-like cells under different gravity conditions
Patch-clamp Experimente mit humanen neuronen-ähnlichen Zellen unter variablen Schwerkraftbedingungen
Florian Peter Michael
Kohn
570
Patch-Clamp-Methode , Nervenzelle , Ionenkanal
Parabelflug , Neuronen Patch clamp , parabolic flight , neurons , ion channels
Gravitation influences many physical, chemical and biological processes. Cells and their behaviour are no exception. The gravitational impact on the activity of neuronal cells is very important with the perspective of manned space missions. Previous experiments with vertebrates showed that the velocity of neuronal impulses (action potentials) in nerve fibres is decreasing under zero gravity and is increasing at high gravity. There are many theories about the changed properties of the nervous systems under zero gravity, but the molecular principles are mostly unexplored.
For this dissertation hardware for patch clamp experiments under microgravity was developed. The patch clamp technique is a common used tool in investigating the electrophysiological properties of cells and single ion channels. Since the conditions during parabolic flights render classic patch clamp nearly impossible, advanced chip-based planar patch-clamp hardware, the Port-a-Patch from Nanion Technologies was integrated into a setup. This setup had to comply with the mandatory design and safety regulations to be used in parabolic flights. Two parabolic flight campaigns were used to validate the hardware, adapt the patch clamp procedures to the special conditions during a parabolic flight (as time pressure and vibrations) and to choose a suitable cell line from the available cell lines. As the laboratory conditions on ground were insufficient at the beginning of the project, the main focus had to lie on robust cells. The SH-SY5Y cell line was chosen for their robustness (they already have been used successfully by other teams) and their origin from the human brain (glioblastoma).
During two subsequent parabolic flight campaigns patch clamp experiments were performed and whole cell currents of SH-SY5Y cells were recorded with increasing success rate. Pulse protocols were used to create current-voltage (I-V) characteristics. To obtain 20 seconds of microgravity, two phases of hypergravity, each lasting 20 seconds, had to be endured by the passengers. This fact allowed the subsequent recording of whole cell currents of the same cell during normal Gravity (1g), hypergravity (1.8g) and microgravity (approx. 10-3g) to compare the I-V characteristics of the different gravity conditions.
For SH-SY5Y cells it was shown that a gravity dependence of the whole cell currents exists. The micro- and hypergravity whole cell currents were changed compared to 1g flight controls. At -20 and -10mV, the hypergravity current was significantly decreased compared to 1g, by 13.5% at -20mV and by 7.4% at -10mV.
A significant 1.8g current < 0g current relation could be observed at potentials between -20 and +10mV. At -20mV the microgravity whole cell currents were increased by 13.5%, at -10mV by 7.4%, at 0mV by 6.2% and at +10mV by 3.9%.
The duration and complexity of the used pulse protocols were limited by the time of each gravity phase (20-22 seconds).
In a last parabolic flight campaign, therefore the passive electrophysiological properties of the cell membrane were investigated. As the laboratory conditions at the site were greatly improved in the meantime, especially for cell culture, new cell lines could be tested for their usability. SNB19 cells, also originating from the human brain (astrocytoma) were chosen due to their good sealing quality and stability compared to SH-SY5Y cells and constant pulse protocols near the estimated resting potential (-80 and -60mV) were performed.
At constant -80mV and -60mV, it was shown that the whole cell currents during the variable gravity conditions are significantly increased compared to the 1g in-flight controls. The hypergravity current of SNB19 was increased by 2.2% at -80V and by 8.2% at -60mV. The microgravity current was increased by 4.1% at -80mV and 3.7% at -60mV.
The acquired I-V characteristic of SNB19 differs from the I-V characteristic of SH-SY5Y.
These findings show that the planar patch clamp technique can be used in parabolic flights to investigate the electrophysiological properties of single. Furthermore the findings suggest that the electrophysiological properties of single cells originating from the human brain exist are gravity dependent.
Die Schwerkraft beeinflusst viele physikalische, chemische und biologische Prozesse. Zellen und ihr Verhalten bilden dabei keine Ausnahme. Der Einfluss der Gravitation auf die Aktivität neuronaler Zellen ist wichtig, vor allem auch im Ausblick auf bemannte Weltraummissionen.
Frühere Experimente mit Wirbeltieren zeigten, dass die Leitungsgeschwindigkeit von Nervenfasern für Aktionspotentiale unter Schwerelosigkeit abnimmt und unter hoher Schwerkraft zunimmt. Es gibt viele Theorien über die veränderten Eigenschaften des Nervensystems in der Schwerelosigkeit, aber die molekularen Grundlagen sind bis heute weitgehend unbekannt.
Für diese Arbeit wurde die Hardware für ein Patch Clamp System entwickelt, welches in der Schwerelosigkeit eingesetzt werden kann. Die Patch Clamp Technik ist ein verbreitetes Werkzeug um die elektrophysiologischen Eigenschaften von Zellen und einzelnen Ionenkanälen zu untersuchen. Da die Bedingungen während eines Parabelfluges klassisches Patchen beinahe unmöglich machen wurde ein planares Patch Clamp System, der Port-a-Patch von Nanion, in einen Experimentaufbau integriert. Der Experimentaufbau wurde nach den Konstruktions- und Sicherheitsregeln entwickelt und gebaut, die für die Teilnahme an Parabelflügen vorgeschrieben waren. Zwei Parabelflugkampagnen wurden verwendet um den Entwurf bezüglich Funktionalität und Sicherheit zu validieren. Des Weiteren wurden die Patch Clamp Prozeduren an die speziellen Bedingungen während des Parabelflugs (wie Zeitdruck und Vibrationen) angepasst, und eine passende Zelllinie wurde aus den zur Verfügung stehenden Kulturen ausgewählt. Da die Laborbedingungen vor Ort zu Beginn des Projekts nicht ausreichend waren musste das Hauptaugenmerk auf der Unempfindlichkeit der Zelllinie liegen. Die Zelllinie SH-SY5Y wurde aufgrund ihrer Robustheit (sie wurde bereits von anderen Gruppen erfolgreich verwendet) und ihrem Ursprung aus dem menschlichen Hirn (Glioblastom) ausgewählt.
Während zwei folgender Parabelflugkampagnen wurden Patch Clamp Experimente mit steigender Erfolgsrate durchgeführt und Ganzzellströme von SH-SY5Y Zellen wurden aufgezeichnet. Spannungsprotokolle wurden verwendet um Strom-Spannungs-Kennlinien (I-V) zu erstellen. Um 20 Sekunden Schwerelosigkeit im Flugzeug zu erhalten waren zwei Hypergravitationsphasen, jeweils 20 Sekunden lang, notwendig. Dies wiederum ermöglichte die aneinandergereihte Aufnahme von Ganzzellströmen derselben Zelle während normaler Schwerkraft, Hypergravitation (1.8g) und Mikrogravitation (ca. 10-3g). Dadurch konnten die
I-V-Kennlinien der einzelnen Gravitationsphasen miteinander verglichen werden.
Für SH-SY5Y Zellen konnte gezeigt werden, dass eine Schwerkraftabhängigkeit der Ganzzellströme existiert. Verglichen mit den 1g-Kontrollen während des Fluges änderten sich die Ganzzellströme während der veränderten Schwerkraftbedingungen. Bei -20 und -10mV waren die Ganzzellströme signifikant erniedrigt, um 13,5% bei -20mV und um 7,4% bei -10mV.
Ein signifikantes 1.8g-Ströme < 0g-Ströme Verhältnis konnte zwischen -20 und +10mV beobachtet werden. Im Vergleich zu den Mikrogravitations-Strömen waren die 1.8g-Ganzzellströme bei -20mV um 13,5%, bei -10mV um 7,4%, bei 0mV um 6,2% und bei +10mV noch um 3,9% vergrößert.
Die verwendeten Spannungsprotokolle wurden in ihrer Dauer und Komplexität durch die Länge der einzelnen Gravitationsphasen (20-22 Sekunden) limitiert.
In einer letzten Parabelflugmission wurden deshalb die passiven elektrophysiologischen Eigenschaften der Zellmembran untersucht. Da sich inzwischen die Laborbedingungen vor Ort, vor allem für Zellkulturen, stark verbessert hatten konnten neue Zelllinien getestet werden. SNB19 Zellen, die ihren Ursprung ebenfalls im menschlichen Hirn (Astrozytom) haben, wurden aufgrund ihres, im Vergleich zu SH-SY5Y, sehr guten Sealverhaltens (Wahrscheinlichkeit und Stabilität) ausgewählt. Es wurden konstante Pulsprotokolle nahe des vermuteten Ruhepotentials (-80 und -60mV) von SNB19 Zellen durchgeführt.
Bei -80 und -60mV konnte gezeigt werden, dass die Ganzzellströme von SNB19 Zellen unter Hyper- und Mikrogravitation verglichen mit den 1g-Flugkontrollen signifikant erhöht sind. Die 1,8g-Ganzzellströme waren bei -80MV um 2,2% erhöht, bei -60mV um 8,2%. Die Ströme unter Mikrogravitation waren bei -80mV um 4,1%, bei -60mV um 3,7% erhöht.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die planare Patch Clamp Technik im Rahmen von Parabelflugmission erfolgreich verwendet werden kann um die elektrophysiologischen Eigenschaften von einzelnen Zellen zu untersuchen. Weiterhin legen die Ergebnisse nahe, dass die elektrophysiologischen Eigenschaften von Zellen, welche ihren Ursprung im menschlichen Gehirn haben, gravitationsabhängig sind.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Wolfgang
Hanke
Prof. Dr.
2010-08-04
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-5001
application/pdf
eng
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/500/
oai:opus.uni-hohenheim.de:505
2010-10-22T16:02:26Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Selective transformations of substituted aryl compounds to fluorenes and phosphoramidates : synthetic and spectroscopic studies
Selektive Transformationen von substituierten Aryl-Verbindungen zu Fluorenen und Phosphoramidaten : synthetische und spektroskopische Untersuchungen
Reda
Haggam
570
Fluoren , Fluorenonderivate
Fluorenes , Palladium-catalyzed cyclization , Hipposudoric acid and norhipposudoric acid, Fluoren-9-ones , Pschorr cyclization , Phosphoramidates
Because of their diverse biological properties and their high potential for the development of new drugs the synthesis of fluorenes and related systems such as benzo[b]fluorenes is of great interest in the fields of organic and medicinal chemistry. The most relevant benzo[b]fluorenes include the naturally occurring kinamycins. Recently, two fluorene derivatives have been isolated from the sweat of hippopotamus (Hippopotamus amphibius). The biological function of the two dyes named hipposudoric acid (4) and norhipposudoric acid (5) is still unknown.
For the synthesis of fluorenes a number of synthetic approaches have been developed. Among the most important methods there are the intramolecular electrophilic substitution, the Pschorr cyclization and palladium-mediated intramolecular cyclizations. The first part of the present study focusses on the construction of fluorenes carrying several methoxy groups by employing the Pschorr cyclization and the palladium-mediated intramolecular cyclization of suitable substrates. A comparison of the two methods is also presented. In addition, the cleavage of the methyl ethers 203 into the corresponding hydroxy-substituted fluoren-9-ones 206 is also included in the first part.
To begin with, the synthesis of hydroxy- and alkoxy-substituted fluoren-9-ones through Pschorr cyclizations was studied. For the preparation of the substrates 233 the bromides 229 were first lithiated with t-butyllithium and then reacted with the aldehydes 231. Using this method it was possible to prepare the secondary alcohols 233a-e with excellent yields ranging from 87 to 98 % (Scheme 74).
Treatment of the secondary alcohols 233a-e using K2Cr2O7 as an oxidant gave the corresponding ketones 234a-e with very good yields (85 to 92 %; Table 16).
Reduction of the nitro group of the substituted ketones 234a-e using iron powder resulted in the formation of substituted 2-aminobenzophenones 235a-e with very good results (Table 17).
The compounds 235a-e were cyclized to furnish the methoxy-substituted fluoren-9-ones by Pschorr cyclizations. For this purpose the substituted 2-aminobenzophenones 235a-e were oxidized to the corresponding diazonium salts with n-amylnitrite in glacial acetic acid at 0 °C which underwent cyclization to give the methoxy-substituted fluoren-9-ones 236a-e with yields ranging from 72 to 86 % (Table 18).
Ether cleavage of the methoxy-substituted fluoren-9-ones 236a-e performed using boron tribromide resulted in the formation of the hydroxy-substituted fluoren-9-ones 242a-e with yields between 60 and 84 % (Table 19).
These results show that the Pschorr cyclization allows for the preparation of substituted fluoren-9-ones in four steps from readily available starting materials.
Palladium-mediated reactions play a very important role in current organic synthesis. Therefore, it was studied whether the palladium-mediated cyclizations of 2-iodo-substituted benzophenones 243 can be employed for the efficient synthesis of fluoren-9-ones. It was of great interest to learn whether this method is superior to the Pschorr cyclization approach. For this purpose, the 2-iodobenzophenone derivatives 243a-f were synthesized. They were obtained by reaction of the 2-amino-substituted benzophenones 235 with n-amylnitrite followed by treatment with KI. Following this procedure, the iodides 243a-e could be obtained with yields between 65 and 73 % (Table 20).
Compound 243f was synthesized by intermolecular Friedel-Crafts acylation of 228 with 244 in 97 % yield (Scheme 75).
It turned out that the best results for the palladium-mediated cyclization of the iodides 243a-c,e,f could be achieved when PdCl2(PPh3)2 was used as a palladium reagent in the presence of NaOAc as a base and DMA as a solvent. Heating at 130 °C afforded the fluoren-9-ones 236a-c,e,f with yields in the range between 31 and 86 % (Scheme 76).
On the whole, it can be concluded that the palladium-catalyzed intramolecular arylations of 243 suffer from high palladium-loadings, high reaction temperatures and long reaction times. In addition, in a few cases the yields for the palladium-mediated cyclizations are not sufficient. Compared to the results of the Pschorr cyclizations the palladium-mediated cyclizations need an extra step; i.e. the transformation of the 2-aminobenzophenones 235 into the corresponding 2-iodobenzophenones 243. This is why the Pschorr cyclization is more efficient for the synthesis of fluoren-9-ones 236 than the palladium-mediated cyclization.
In addition, attempts were undertaken to cyclize the substituted 2-nitrobenzophenones 234b,c to the corresponding acridinones 205. When the benzophenones were treated with triethyl phosphite (161) the unexpected formation of diethyl N-arylphosphoramidates 251b (59 % yield) and 251c (62 % yield) was observed.
With these unexpected results in hand it was decided to develop a new synthetic protocol for the efficient conversion of nitroarenes into the corresponding phosporamidates. Phosporamidate oligonucleotides play an important role in medicinal chemistry because they have been considered for diagnostic as well as therapeutic applications within the antisense field. The preparation of phosphoramidate substituted nucleoside analogues is also of great interest as many of them exhibit anticancer, antiviral (anti-HIV) and spermicidal activities. Therefore, the second goal of this thesis was to develop a practical and efficient method for the synthesis of dialkyl N-arylphosphoramidates by reaction of readily available nitroarenes with tervalent phosphorous reagents such as triethyl phosphite or trimethyl phosphite under both thermal and microwave conditions. In order to evaluate the scope of this conversion it was necessary to study the effects of substitution on the aromatic ring at different positions. It was found that nitroarenes 255a-o can easily be transformed into the corresponding diethyl N-arylphosphoramidates 256a-o by treatment with an excess of triethyl phosphite (161) or trimethyl phosphite (257). Yields were in the range of 52 to 79 % (Table 21).
The results obtained clearly indicate that ? in contrast to previous reports ? the reaction of nitroarenes with trialkyl phosphites is a practical and efficient method for the selective preparation of dialkyl N-arylphosphoramidates in one synthetic operation.
The structures of all compounds prepared during this study have been elucidated unambiguously by analytical and spectroscopic methods including NMR spectroscopy, mass spectrometry, UV spectroscopy, IR spectroscopy and elemental analysis.
Aufgrund ihrer vielfältigen biologischen Eigenschaften und ihres großen Potentials für die Entwicklung neuer Medikamente ist die effiziente Synthese von Fluorenen und verwandten Systemen wie den Benzo[b]fluorenen von großem Interesse in der Organischen und Medizinischen Chemie. Zu den interessantesten Benzo[b]fluorenen zählen die natürlich vorkommenden Kinamycine. Kürzlich wurden zwei Fluorenderivate aus dem Schweiß des Nilpferdes (Hippopotamus amphibius) isoliert, die als Hipposudorinsäure (4) und Norhipposudorinsäure (5) bezeichnet wurden. Über die biologische Funktion dieser zwei Farbstoffe ist bislang nur wenig bekannt.
Für die Synthese von Fluorenen setzt man vor allem intramolekulare elektrophile aromatische Substitutionen, Pschorr-Cyclisierungen und Palladium-vermittelte intramolekulare Cyclisierungen ein.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wird der Aufbau mehrfach Methoxy-substituierter Fluorenone durch Pschorr-Cyclisierungen und Palladium-vermittelte intramolekulare Cyclisierungen geeigneter Substrate beschrieben und miteinander verglichen. Darüberhinaus wird die Spaltung der Methylether in die entsprechenden Hydroxy-substituierten Fluorenone vorgestellt.
Zunächst wurde die Synthese von Hydroxy- und Alkoxy-substituierten Fluoren-9-onen durch Pschorr-Cyclisierung untersucht. Für die Darstellung der Substrate 233 wurden die Bromide 229 mit t-Butyllithium lithiiert und dann mit den Aldehyden 231 umgesetzt. Unter Verwendung dieser Methode war es möglich, die sekundären Alkohole 233a-e mit ausgezeichneten Ausbeuten zwischen 87 und 98 % herzustellen (Schema 74).
Die anschließende Behandlung der sekundären Alkohole 233a-e mit K2Cr2O7 als Oxidationsmittel ergab die entsprechenden Ketone 234a-e mit sehr guten Ausbeuten zwischen 85 und 92 % (Tabelle 16).
Die Reduktion der Nitrogruppe der substituierten Ketone 234a-e mit Eisenpulver führte mit sehr guten Ausbeuten zur Bildung der substituierten 2-Aminobenzophenone 235a-e (Tabelle 17).
Es gelang dann, die Verbindungen 235a-e durch Pschorr-Cyclisierung in die Methoxy-substituierten Fluoren-9-one umzuwandeln. Dazu wurden die substituierten 2-Aminobenzophenone 235a-e unter Verwendung von n-Amylnitrit in Essigsäure bei 0 °C zu den entsprechenden Diazoniumsalzen oxidiert. Die so gebildeten Diazoniumsalze cyclisierten dann mit Ausbeuten zwischen 72 und 86 % zu den Methoxy-substituierten Fluoren-9-onen 236a-e (Tabelle 18).
Die Etherspaltung der Methoxy-substituierten Fluoren-9-one 236a-e gelang mit Bortribromid und lieferte die entsprechenden Hydroxy-substituierten Fluoren-9-one 242a-e mit 60 bis 84 % Ausbeute (Tabelle 19).
Diese Ergebnisse zeigen, dass man substituierte Fluoren-9-one mit Hilfe der Pschorr-Cyclisierung aus leicht zugänglichen Substraten in insgesamt vier Stufen darstellen kann.
Palladium-vermittelte Reaktionen spielen in der modernen organischen Synthese eine sehr wichtige Rolle. Daher wurde untersucht, ob man Palladium-vermittelte Cyclisierungen substituierter 2-Iodobenzophenone 243 für die effiziente Synthese von Fluoren-9-onen einsetzen kann. Von großem Interesse war in diesem Zusammenhang vor allem die Frage ob diese Methode der klassischen Pschorr-Cyclisierung überlegen ist. Dazu wurden zunächst die 2-Iodobenzophenone 243a-e synthetisiert. Sie ließen sich durch Reaktion der substituierten 2-Aminobenzophenone 235a-e mit n-Amylnitrit und anschließender Behandlung mit KI zugänglich machen. Nach diesem Verfahren erhielt man die Iodide 243a-e mit Ausbeuten zwischen 65 und 73 % (Tabelle 20).
Die Verbindung 243f wurde durch eine intermolekulare Friedel-Crafts Acylierung von 228 mit 244 in einer Ausbeute von 97 % synthetisiert (Schema 75).
Im weiteren Verlauf der Arbeit zeigte sich, dass man die besten Ergebnisse für die Palladium-vermittelten Cyclisierungen der Iodide 243 erhielt, wenn man PdCl2(PPh3)2 als Palladium-Reagenz in Gegenwart von NaOAc als Base und DMA als Lösungsmittel einsetzte. Erhitzen der Reaktionsmischung auf 130 °C führte zur Bildung der Fluoren-9-one 236a-c,e,f mit Ausbeuten zwischen 31 und 86 % (Schema 76).
Alles in Allem bleibt festzuhalten, dass die Palladium-vermittelten intramolekularen Arylierungen von 243 verschiedene Nachteile, wie die große Menge an benötigten Palladium-Reagenzien, die hohen Reaktionstemperaturen sowie die langen Reaktionszeiten, aufweisen. Dazu kommt, dass in einigen wenigen Fällen die Ausbeuten nicht ausreichend sind. Im direkten Vergleich mit den Pschorr-Cyclisierungen zeigt sich auch, dass man zur Durchführung der Palladium-vermittelten Cyclisierungen einen zusätzlichen Reaktionsschritt, und zwar die Umwandlung der 2-Aminobenzophenone 235 in die entsprechenden 2-Iodbenzophenone 243, benötigt. Aus diesen Gründen ist die Pschorr-Cyclisierung für den effizienten Aufbau der Fluoren-9-one 236 besser geeignet als die Palladium-vermittelte Cyclisierung.
Im Weiteren versuchte man die Cyclisierung der substituierten 2-Nitrobenzophenone 234b,c zu den entsprechenden Acridinonen 205. Wenn die Benzophenone mit Triethylphosphit (161) zur Reaktion gebracht wurden, beobachtete man die unerwartete Bildung der Diethyl-N-arylphosphoramidate 251b (59 % Ausbeute) und 251c (62 % Ausbeute) (Schema 77).
Diese unerwarteten Ergebnisse führten zur Entwicklung einer neuen Synthesemethode für die effiziente Transformation von Nitroarenen in die entsprechenden Phosporamidate. Phosporamidat-Oligonucleotide spielen in der Medizinischen Chemie eine wichtige Rolle, da sie im Rahmen von Antisense-Ansätzen sowohl für den Einsatz in der Diagnostik als auch für den Einsatz als Therapeutika in Betracht kommen. Die Herstellung von Phosporamidat- substituierten Nucleosidanaloga ist ebenfalls von großem Interesse, da viele von ihnen Antitumor-Eigenschaften aufweisen bzw. antiviral (anti-HIV) oder spermizid wirksam sind.
Daher war es das Ziel, eine praktische und effiziente Methode für den Aufbau von Dialkyl N-arylphosphoramidaten durch Umsatz leicht zugänglicher Nitroarene mit tervalenten Phosphor-Reagenzen wie Triethylphosphit oder Trimethylphosphit sowohl unter thermischen als auch unter Mikrowellenbedingungen zu entwickeln. Um die Anwendungsbreite der Reaktion zu untersuchen, war es nötig, den Einfluss verschiedener Substituenten an unterschiedlichen Ringpositionen des Nitroaromaten zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass sich die Nitroarene 255a-o leicht und mit Ausbeuten zwischen 52 und 79 % durch Reaktion mit einem Überschuss an Triethylphosphit (161) bzw. Trimethylphosphit (257) in die entsprechenden Diethyl N-arylphosphoramidate 256a-o umwandeln lassen (Tabelle 21).
Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen ganz klar, dass die Reaktion von Nitroarenen mit Triethylphosphit ? abweichend von bislang bekannten Ergebnissen ? ein praktisches und effizientes Verfahren für die selektive Darstellung von Dialkyl N-arylphosphoramidaten in einem Schritt darstellt.
Die Strukturen aller im Rahmen dieser Arbeit synthetisierten Substanzen wurden zweifelsfrei durch analytische und spektroskopische Methoden, wie NMR-Spektroskopie, Massenspektrometrie, UV-Spektroskopie, IR-Spektroskopie und Elementaranalyse aufgeklärt.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Uwe
Beifuss
Prof. Dr.
2010-09-30
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-5058
application/pdf
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_ubh.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/505/
oai:opus.uni-hohenheim.de:520
2010-11-23T14:15:22Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Variabilität und Induzierbarkeit von Cytochrom P450 Monooxygenasen in humanen Leberproben und Hepatozyten : Untersuchungen mittels LC-MS/MS Cocktail-Assay und RNA-Interferenz
Variability and induction of cytochrome P450 monooxygenases in human liver samples and hepatocytes : analysis using LC-MS/MS cocktail-assay and RNA-interference
Diana M.
Feidt
570
Cytochrom P-450 , Enzyminduktion , RNS-Interferenz
P450 Aktivität , CYP Induktion , humane Hepatozyten , RNA-Interferenz , Statine P450 activity , CYP induction , human hepatocytes , RNA-interference , statins
Die Variabilität der Expression und Funktion der P450 Enzyme (CYPs) ist eine der Ursachen dafür, dass bei gleicher Dosierung eines Medikaments Intensität und Dauer von Wirkungen und Nebenwirkungen von Patient zu Patient unterschiedlich sein können. Diese interindividuelle Variabilität der Enzyme lässt sich heute noch nicht lückenlos erklären. Prinzipiell können biologische Faktoren (z.B. Alter, Geschlecht, Hormonstatus), Umweltfaktoren (Ernährung, Rauchen, Arzneimittelinteraktionen) sowie genetische Faktoren, z.B. Polymorphismen, Enzymfunktionen beeinflussen.
Um dieser Problematik nachgehen zu können und auf Aktivitätsebene relativ schnell und einfach Unterschiede nachzuweisen, wurde ein LC-MS/MS basierter P450 Cocktail-Assay zur Quantifizierung der sieben wichtigsten Enzymaktivitäten für den Arzneistoffwechsel entwickelt und in humanen Hepatozyten etabliert.
Am Beispiel der Arzneistoffgruppe der HMG-CoA Reduktasehemmer (Statine) wurden Untersuchungen der Cytochrom P450 Enzyme durch zeitabhängige Enzyminduktionsprofile mittels Cocktail-Assay und mRNA-Expression gemessen.
Das CYP2C8 wurde als neues, von Statinen stark induziertes P450 Enzym identifiziert. Es wurde eine bis zu 20-fache Zunahme der Aktivität durch Atorvastatin und eine ~10-fache Zunahme durch Simvastatin- und Lovastatinbehandlung nachgewiesen. Die Enzyme CYP3A4, CYP2B6 und CYP2C9 zeigten geringere, aber auch deutliche Aktivitätssteigerungen durch die Behandlung mit Atorvastatin und Simvastatin (4 bis 11-fach). Lovastatin und Rosuvastatin hatten geringere Effekte.
Die Expression der mRNA entsprach weitestgehend den Beobachtungen der Aktivitäten, wobei jedoch die Auswirkungen dynamischer und drastischer mit wesentlich höheren Induktionsleveln ausfielen.
Die Ergebnisse deuten auf einen stärkeren Einfluss der Behandlung mit Statinen auf P450 Expression und Aktivität hin, als bisher angenommen. Dies könnte besonders für die Co-Medikation mit anderen über CYP2C8 metabolisierten Arzneistoffen von entscheidender Bedeutung sein.
Aufgrund von Korrelationsanalysen der P450 Enzymaktivitäten zu ihrem spezifischen Proteingehalt in humanen Leberproben (Leberbank am IKP) wurden unterschiedliche Ergebnisse hinsichtlich der Funktion einzelner CYP-Enzyme beobachtet. Manche CYP-Enzyme, wie z.B. CYP3A4 mit der Hydroxylierung von Atorvastatin oder CYP1A2 mit der Bildung von Acetaminophen zeigten sehr gute Korrelationen. Andere Enzyme wie z.B. CYP2C9 mit dem spezifischen Substrat Diclofenac, korrelierten wesentlich schlechter.
Diese Unterschiede könnten neben biologischen Faktoren und Umwelteinflüssen mit Variabilität in den Enzymen NADPH:P450 Oxidoreduktase (POR), Cytochrom b5 oder den beiden Progesteronrezeptor-Membrankomponenten PGRMC1 und PGRMC2 zusammenhängen. Denn als potentielle Elektronendonatoren der CYP-Enzyme wären diese maßgeblich am Metabolismus von Xenobiotika beteiligt.
Zur Untersuchung, welchen Einfluss die Elektronendonator-Proteine auf die Aktivität der CYP-Enzyme haben, wurde die Technik einer lentiviral basierten RNA-Interferenz (RNAi) für diese Gene in primären humanen Hepatozyten entwickelt und die P450 Aktivitäten mittels Cocktail-Assay nach dem »Knock-Down« dieser Gene bestimmt.
Für die P450 Reduktase wurde ein erfolgreiches »Gene Silencing« von durchschnittlich 85% auf mRNA-Ebene erzielt. Die Expression von Cytochrom b5 wurde um 51% reduziert, PGRMC1 um ca. 30%. Für PGRMC2 konnte bisher kein signifikanter »Knock-Down« nachgewiesen werden.
Nach dem »Silencing« der Reduktase wurde für die P450 Enzymaktivitäten nach 4 Tagen durchschnittlich ein leichter Rückgang von ca. 10-30% beobachtet. Nach einer Zeitdauer von 7 Tagen wurde für das CYP3A4 im Vergleich zur Kontrolle nur noch eine Restaktivität von ungefähr 5% detektiert.
Für die beiden anderen potentiellen Elektronendonatoren Cytochrom b5 und PGRMC1 wurde entsprechend eine um 85% bzw. 75% reduzierte CYP3A4 Aktivität nachgewiesen.
Diese ersten Ergebnisse sprechen deutlich für eine Interaktion der Enzyme POR, Cytochrom b5 und PGRMC1 mit den Arzneistoff metabolisierenden P450 Enzymen.
The variability of the expression and function of the P450 enzymes (CYPs) is a cause for having different intensities and lengths of effects as well as side effects when patients are given the same dosage of medication. Up to this day, one cannot allover explain this inter individual variability of expression and activity of the enzymes. In general, there are several factors that may affect the variability, including biological factors (such us age, gender, hormonal status), environmental factors (such as nutrition, smoking, medication) as well as genetic factors like polymorphisms
In order to solve this problem and to analyze relatively easy and fast activity differences, we developed an LC-MS/MS based P450 activity cocktail assay to quantify and detect simultaneously the seven most important CYPs as judged by their roles in the metabolism of clinically used drugs. The assay was established for use in in human hepatocytes as well as in recombinant and microsomal enzymes.
We used the newly developed model-substrate cocktail assay to analyze the time-dependent induction of seven drug metabolizing cytochrome P450 activities as response to treatment of primary human hepatocytes with different statins.
The strongest induction was observed for amodiaquine N-desalkylation of CYP2C8, which was induced up to 20-fold by atorvastatin and approximately 10-fold by simvastatin and lovastatin. Enzymes CYP3A4, CYP2B6 and 2C9 showed lower, but also significant induction after treatment with atorvastatin and simvastatin (4-11-fold). lovastatin and rosuvastatin demonstrated minor effects.
Quantitative RT-PCR confirmed corresponding changes on the mRNA level with even more dramatic induction up to almost 100-fold.
These data suggest a broader inducing effect of statins on cytochrome P450 expression and activity than previously known, thus further emphasizing their drug-drug interaction potential, especially for CYP2C8.
Based on correlation analysis with P450 enzyme activity to their specific protein amount in human liver samples (liverbank IKP) were different functional results observed. Enzymes like CYP3A4 with atorvastatin hydroxylation or CYP1A2 with formation of acetaminophen showed very good correlations. Others like i.e. CYP2C9 with specific substrate diclofenac correlated much lower.
Besides biological and environmental factors could these differences based on variability of the enzymes NADPH:P450 oxidoreductase (POR), cytochrome b5 or the two progesterone receptor-membrane components PGRMC1 and PGRMC2. After all, they would take active part in the metabolism of the xenobiotica as possible electron donors of the CYP enzymes.
In order to analyze what kind of influence these proteins have on CYP enzyme activity, we developed a lentiviral based RNA-interference (RNAi) method in human hepatocytes and determined P450 activity with cocktail-assay after knocking down these genes.
For the P450 reductase, we achieved a successful gene silencing of about 85% on mRNA level. The expression of cytochrome b5 was reduced by 51%, PGRMC1 about 30%. So far, it has not been possible to prove a significant knock down of PGRMC2.
After silencing of reductase, an average light decline of about 10-30% of P450 enzyme activities was observed after 4 days. After a period of 7 days, a rest activity of CYP3A4 of only about 5% was detected. For both other potential electron donators cytochrome b5 and PGRMC1 was a reduced activity of 85% and 75% determined.
These first results indicate a clear interaction of the enzymes POR, cytochrome b5 and PGRMC1 with the drug metabolizing enzymes.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Lutz
Graeve
Prof. Dr.
2010-10-28
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-5205
application/pdf
ger
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/520/
oai:opus.uni-hohenheim.de:508
2010-11-29T08:39:31Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Untersuchungen zur Biogenese von Proteinen in der mitochondrialen Innenmembran
Studies on the biogenesis of proteins in the mitochondrial inner membrane
Olga
Randel
570
Proteine , ATP , Biogenese
Proteinimport , Assemblierung , mitochondriale Innenmembran Protein , Assemblz , Mitochondria , ATP Synthases
Mitochondrien und Prokaryonten weisen vielerlei Ähnlichkeiten auf, vermutlich sind sie in der Evolution aus gemeinsamen Vorläufern hervor gegangen. So ist zu erwarten, dass sich ausgeprägte Ähnlichkeiten auch in der Biogenese ihrer Proteine nachweisen lassen. In der vorliegenden Studie wurde dieser Vermutung in Untersuchungen zur Biogenese bestimmter Proteinkomplexe der mitochondrialen Innenmembran nachgegangen. Als Modellorganismus diente dabei die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae.
(1) Die γ-Untereinheit der ATP-Synthasen ist in Mitochondrien und Prokaryonten hoch konserviert. Aus älteren Untersuchungen ist bekannt, dass Deletionen am N- oder C-Terminus der γ-Untereinheit nur eine überraschend geringe Reduktion der enzymatischen Aktivität zur Folge haben. In der Experimenten der vorliegenden Studie wurde nun gefunden, dass N- und C-Terminus der γ-Untereinheit für eine effiziente Assemblierung in der ATP-Synthase in den Mitochondrien der Hefe essentiell sind. Bei einer Deletion von 9 Aminosäuren am N-Terminus oder 10 Aminosäuren am C-Terminus wurde die γ-Untereinheit effizient in die Mitochondrien importiert. Der Anteil der Untereinheit, der dann innerhalb von 10 Min. bei 25°C assembliert wurde, reduzierte sich aber um etwa die Hälfte. Deletionen von mehr als 9 N-terminalen oder mehr als 20 C-terminalen Aminosäuren reduzierten den Anteil der assemblierten Untereinheit um mehr als 90%. Hefe-Stämme, die eine verkürzte γ-Untereinheit synthetisierten, waren auf Glycerin als Kohlenstoffquelle nicht lebensfähig. Vermutlich sind N- und C-Terminus der Untereinheit in den ATP-Synthasen sowohl der Mitochondrien, als auch in der Prokaryonten für die Assemblierung von größerer Bedeutung als für die Energieübertragung.
(2) Die Metabolittranslokatoren der mitochondrialen Innenmembran sind vermutlich erst im Kontext der Evolution der eukaryontischen Zellen entstanden. Gemeinsam ist den Metabolittranslokatoren das Sequenzmotiv P x (D/E) x x (K/R), das als Carrier signature bezeichnet wird. Für ein Mitglied der Proteinfamilie, den Dicarboxylattranslokator, wurde nun gefunden, dass die Carrier signature die Biogenese des Proteins wesentlich erleichtert. Insbesondere wird der Transport des neu synthetisierten Proteins vom Cytosol in den Intermembranraum wesentlich beschleunigt.
(3) Das Protein Oxa1 gehört zu einer Proteinfamilie, zu der auch das Protein YidC der Prokaryonten zählt. Sowohl Oxa1, als auch YidC sind Mediatoren der Proteininsertion in ihren jeweiligen Membranen, und in dieser Funktion u.a. an ihrer eigenen Biogenese beteiligt. Eine Reihe verschiedener Experimente zur Biogenese des mitochondrialen Oxa1 hat nun ergeben, dass neu synthetisiertes Oxa1 nach Import in die Mitochondrien wahrscheinlich nicht vollständig in die mitochondriale Matrix transportiert wird. Vielmehr scheint es im TIM23-Komplex, der Proteintranslokase der Innenmembran, zu akkumulieren und dann unmittelbar in die Lipidphase der Membran zu inserieren. Damit zeigt das Oxa1 eine ähnliche Biogenese wie das bakterielle YidC, das zunächst von der SecYEG-Translokase aufgenommen und dann unmittelbar in die Plasmamembran eingelagert wird. Oxa1 und YidC scheinen somit nicht nur in ihrer Struktur, sondern auch in ihrer Biogenese und in ihrer Funktion signifikante Ähnlichkeiten zu haben.
Insgesamt zeigte sich in den Experimenten der vorliegenden Studie, dass sich mitochondriale und prokaryontische Proteine auch nach mehr als zwei Milliarden Jahren getrennter Evolution selbst in molekularen Details ihrer Funktion noch sehr ähnlich geblieben sind.
Mitochondria and prokaryotes show many similarities and it is a well established notion that they have common ancestors. It is therefore reasonable to expect significant similarities also in the biogenesis of their proteins. This study followed this idea in investigations on the biogenesis of protein complexes in the mitochondrial inner membrane. The yeast Saccharomyces cerevisiae served as a model organism.
(1) The γ-subunit of ATP synthases is highly conserved both in mitochondria and in prokaryotes. Previous studies demonstrated that deletions at the N- or C-terminus of the subunit entail only mild reductions in the enzymatic activity, and the reason of the conserved structure was enigmatic. The experiments of this study show that N- and C-terminus of the γ-subunit are essential for an efficient assembly in the ATP synthase. A deletion of 9 residues at the N-terminus or 10 residues at the C-terminus reduced the ratio of the subunit that assembled within 10 min. at 25°C by about 50%. Deletions of more than 9 N- or more than 20 C-terminal residues reduced the share of the assembled subunit by more than 90%. Yeast strains that synthesized a shortened γ-subunit did not grow on glycerole. N- and C-terminus are probably more relevant for assembly of the ATP synthase than for the transmission of energy. It is proposed that this is the case both for mitochondria and for prokaryotes.
(2) The metabolite carrier proteins of the mitochondrial inner membrane were probably newly developed during the evolution of the eukaryotic cells. A common sequence motif of all carrier proteins is the carrier signature, P x (D/E) x x (K/R). The data of this study show that the carrier signature substantially facilitates the biogenesis of the dicarboxylate carrier (DIC). In particular, the translocation of this protein across the mitochondrial outer membrane is significantly accelerated.
(3) The mitochondrial inner membrane protein Oxa1 is a member of a protein family that includes the bacterial protein YidC. Both Oxa1 and YidC act as mediators of protein insertion in their membranes, and both proteins participate in their own biogenesis. In this study, a series of experiments indicates that newly synthesized Oxa1 is not imported into the mitochondrial matrix, but accumulates in the inner membrane TIM23 translocase, for direct integration into the lipid bilayer. Oxa1 thereby shows a similar principle of membrane insertion as prokaryotic YidC. This was previously shown to first accumulate in the SecYEG translocase and then to directly integrate into the bacterial plasmamembrane. Oxa1 and YidC thus seem to resemble each other both in their structure and in their biogenesis.
In summary, the experiments show that mitochondrial and prokaryotic proteins, after two billion years of separate evolution, have retained surprising similarities, even in molecular details of their function.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Joachim
Rassow
Prof.
2009-10-22
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-5081
application/pdf
ger
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_mit_pod.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2010/508/
oai:opus.uni-hohenheim.de:522
2011-01-04T11:24:44Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Neue Messtechniken und Simulationen für die Strömungsvorgänge und den örtlichen Stoffübergang in nicht-Newtonschen Fluiden
Gongyuan
Zheng
570
Konvektion , Stoffübergang , Numerische Strömungssimulation , Rheologie , Spacer , Viskosität , Visualisierung
nicht-Newton'sche Flüssigkeiten non-Newtonian fluids
Flow and transport phenomena in non-Newtonian fluids are of significant industrial interest. As a kind of static mixer, spacers play an important role in process engineering concerning problems of mixing, homogenizing and dispersing in connection with residence time behavior up to the enhancement of heat and mass transfer. However, the efficiency of such spacers strongly depends on fluid properties, the characteristic geometry and operating conditions. Additionally, it is very difficult to respond to changed operating conditions for such spacers and ill-designed feed spacers can hinder the realization of a high performance.
Here, experimental and numerical methods were introduced for the investigation of flow phenomena and mass transfer for non-Newtonian fluids in spacer-filled channels.
Strömungs- und Transportvorgänge in nicht-Newton?schen Flüssigkeiten sind von besonderem industriellen Interesse. In der Verfahrenstechnik werden Spacer eingesetzt zur Lösung von Problemen beim Mischen, Homogenisieren und Dispergieren, zur Erzielung eines günstigen Verweilzeitverhaltens sowie zur Steigerung des Stoff- und Wärmetransports. Die Effizienz solcher Spacer hängt stark ab von den Fluideigenschaften, von der Spacer-Geometrie und von den Betriebsbedingungen. Deswegen kommt einer Optimierung dieser Spacer für die jeweiligen Randbedingungen eine wesentliche Rolle zu. Die vorliegende Arbeit befasst sich deswegen mit experimentellen und numerischen Methoden zur Untersuchung der Strömungs- und Transportvorgänge in Kanälen mit Spacern für nicht-Newton?sche Flüssigkeiten.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Volker
Kottke
Prof. Dr. Ing. habil.
2010-11-25
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-5220
application/pdf
eng
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/522/
oai:opus.uni-hohenheim.de:523
2011-01-13T11:28:36Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Identification and functional studies of two novel serine phosphorylation sites of insulin receptor substrate (IRS)-2: Ser 675 and Ser 907
Identifizierung und funktionelle Untersuchungen zweier neuer Serin Phosphorylierungsstellen des Insulinrezeptorsubstrates (IRS) 2: Ser 675 und Ser 907
Louise
Fritsche
570
Insulinrezeptor , Insulin , Insulinresistenz , Insulinstoffwechsel , Phosphorylierung , Protein-Serin-Threonin-Kinasen , Serin
Insulinrezeptorsubstrat , mTOR , ERK1/2 , IRS-2 insulin receptor substrate , insulin , phosphorylation , serine
Insulin receptor substrate (IRS) proteins are major transducers of the insulin and IGF-1 signal into the PI-3 kinase/PKB and the MAP kinase pathway. In addition to tyrosine phosphoryla-tion, a large number of serine/threonine phosphorylation sites enable the IRS proteins to inte-grate different extra- and intracellular stimuli resulting in positive and negative modulation of the insulin and IGF-1 signal. Chronic hyperphosphorylation of serine/threonine sites of IRS-1 is involved in the development of insulin resistance. IRS-2 is of great importance for β-cell survival and for the regulation of hepatic metabolism. The study of serine/threonine phos-phorylations is required to understand the physiological and pathophysiological regulation of this important mediator of insulin signaling. In this thesis two novel IRS-2 serine phosphoryla-tion sites have been identified and characterized (mouse amino acid numbering): Ser 675, which is located in the kinase regulatory loop binding (KRLB) domain unique to IRS-2 and Ser 907, which is adjacent to the Grb2 binding site Tyr 911. Using phospho-site specific antibod-ies both sites were demonstrated to be phosphorylated upon insulin, phorbol ester and ani-somycin treatment in Fao rat hepatoma cells. The phosphorylation was also detected in pri-mary human hepatocytes and in liver tissue of insulin treated or refed mice.
The insulin-induced phosphorylation of Ser 907 was mediated by the MAP kinase ERK1/2. Simulation of a permanent phosphorylation of this site in BHK cells expressing IRS-2 Glu 907 led to a slight decrease of IRS-2 tyrosine phosphorylation with no apparent effect on insulin downstream signaling. The insulin-induced association of IRS-2 with Grb2 in HEK293 cells was abrogated by mutation of the adjacent Tyr 911 to Phe, but not influenced by mutation of Ser 907 to Ala. Of note, the activation of MAP kinase signaling was not impaired in HEK293 cells expressing IRS-2 Phe 911 and not regulated by the expression level of IRS-2 wildtype, but completely dependent on IR expression, indicating the importance of an alternative, IRS-2-Grb2-independent pathway for the activation of MAP kinase signaling in these cells.
The insulin-induced phosphorylation of Ser 675 was dependent on mTOR, but not on the downstream kinase p70 S6K1. Prevention of this phosphorylation in BHK cells or HEK293 cells expressing IRS-2 Ala 675 had no effect on proximal or distal insulin signal transduction. But compared with IRS-2 wildtype, the mutated IRS-2 protein Ala 675 showed increased half life in cycloheximide-treated HEK293 cells. Thus, phosphorylation of Ser 675 could have a similar function as its homologous site Ser 632 in IRS-1 and could be involved in the regula-tion of mTOR-dependent IRS-2 proteasom-mediated protein degradation.
Die Insulin Rezeptor Substrate (IRS) sind bedeutende Vermittler des Insulin- und des IGF-1-Signales in den PI-3 Kinase- und den MAP Kinase-Signaltransduktionsweg. Zusätzlich zu Tyrosinphosphorylierungen ermöglichen eine große Anzahl an Serine/Threonin-Phosphorylierungsstellen der IRS-Proteine die Integration von verschiedenen extra- und in-trazellulären Stimuli was zu einer positiven und negativen Modulation des Insulin- und IGF-1 Signales führt. Chronische Hyperphosphorylierungen der Serin/Threonin-Reste des IRS-1 sind an der Entstehung von Insulinresistenz beteiligt. IRS-2 hat eine besondere Bedeutung für das Überleben der β-Zellen sowie für die Regulation des hepatischen Metabolismus. Die Untersuchung der Serin/Threonin-Phosphorylierungen ist die Voraussetzung um die physio-logische und pathophysiologische Regulation dieses wichtigen Vermittlers des Insulinsignales zu verstehen. In dieser Doktorarbeit wurden zwei neue IRS-2 Phosphorylierungsstellen identi-fiziert und charakterisiert (Maus IRS-2 Aminosäure Nummerierung): Ser 675, das in der IRS-2-spezifischen kinase regulatory loop binding (KRLB) Domäne liegt und Ser 907, das in der Nähe eines Grb2-Bindungsmotives (Tyr 911) liegt. Mit phospho-site-spezifischen Antikörpern wurden beide Phosphorylierungen in Fao Ratten Hepatoma-Zellen nach Insulin-, Phorbo-lester- und Anisomycinstimulation nachgewiesen. Die Phosphorylierungen wurden auch in primären humanen Hepatocyten sowie in Lebergewebe von insulinbehandelten oder gefütter-ten Mäusen detektiert.
Die insulininduzierte Phosphorylierung von Ser 907 wurde durch die MAP Kinase ERK1/2 vermittelt. Die Simulation einer permanenten Phosphorylierung dieses Serinrestes in BHK-Zellen, die IRS-2 Glu 907 transient exprimierten, führte zu einer leichten Abnahme der IRS-2-Tyrosinphosphorylierung hatte aber keinen offensichtlichen Einfluss auf die nachgeordneten Insulin-Signaltransduktionskaskaden. Die insulininduzierte Bindung von Grb2 an IRS-2 war in HEK293 Zellen durch Mutation des benachbarten Tyrosin 911 zu Phenylalanin aufgehoben, wurde jedoch durch eine Mutation von Serin 907 zu Alanin nicht beeinflusst. Die Aktivierung des MAP Kinase Signalweges in IRS-2 Phe 911-überexprimierenden HEK293 Zellen war jedoch nicht beeinträchtigt und war auch nicht induziert durch die Überexpression des Wildtyp IRS-2. Allerdings war die Aktivierung dieses Signalweges vollständig abhängig von der Höhe der Insulinrezeptor-Expression, was auf einen alternativen, IRS-2-Grb2-unabhängigen Sig-nalweg bei der Aktivierung der MAP Kinase hindeutet.
Die insulininduzierte Phosphorylierung von Ser 675 war abhängig von mTOR, jedoch nicht von seiner nachgeschalteten Kinase p70 S6K1. Die nicht-phosphorylierbare Ser 675 Ala Mutante, exprimiert in BHK und HEK293 Zellen, hatte keinen Einfluss auf die proximale oder distale Insulin-Signalweiterleitung. Allerdings hatte das mutierte IRS-2 675 Ala Protein eine verlängerte Halbwertszeit in Cycloheximid-behandelten HEK293 Zellen. Die Phosphorylie-rung von Ser 675 könnte daher eine ähnlich Funktion haben wie das homologe Ser 632 im IRS-1 und an der mTOR-abhängigen proteasomalen IRS-2 Proteindegradation beteiligt sein.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Erwin D.
Schleicher
Prof. Dr. rer. nat.
2010-10-12
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-5232
application/pdf
eng
http://opus.uni-hohenheim.de/doku/lic_mit_pod.php
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/523/
oai:opus.uni-hohenheim.de:574
2011-02-17T16:06:53Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Dekontamination von pharmazeutischen Isolatoren mit verdampftem Wasserstoffperoxid : Charakterisierung von Einflussparametern und Optimierung des Maschinendesigns
Beatriz
Unger-Bimczok
570
Dekontamination , Wasserstoffperoxid , Bioindikator , Bacillus stearothermophilus , Spore , Kondensation
D-Wert , Pharmazeutischer Isolator , VPHP , Spaltgängigkeit , Mikrobiologische Inaktivierung D-value , Pharmaceutical isolator , VPHP , gap pentetration , micorbial inactivation
In the pharmaceutical industry sterile drugs, which can not be terminally sterilized, have to be prepared and handled under aseptic conditions. The application of isolator technology with physical separation of the process from the environment and the operator is commonly used. Prior to the aseptic processing, the inner isolator surfaces have to be treated with a sterilant to reduce the microbial contamination to a defined acceptable level. Today vaporized hydrogen peroxide (VPHP) is most commonly used for this purpose. Different parameters like hydrogen peroxide concentration, humidity, and condensation have an influence onto the microbicidal activity of the decontamination cycle. Also isolator design factors (e.g. material of construction, geometrical structure) can impact the inactivation results. The objective of the presented thesis was to investigate the mode of action of the VPHP and the relationship between different influencing cycle parameters in order to develop a recommendation for optimum decontamination conditions. An additional goal was to analyze the impact of different construction materials, surface finish and geometrical structures onto the inactivation efficiency of the sterilant to improve the design of aseptic processing machines regarding VPHP decontamination.
For the studies an pharmaceutical isolator connected to a VPHP generator was used. Standard decontamination cycles with varying combinations of hydrogen peroxide and water concentration, cycle time and condensation levels were developed. Biological indicators (BIs) with defined initial spore population of Geobacillus stearothermophilus were exposed to the different VPHP cycles. By determination of inactivation kinetics for the microbial test challenge, the sporicidal activity for each set of cycle conditions was evaluated. The applied microbial methods were Most Probable Number (MPN) technique as well as the determination of decimal reduction times (D-values). BIs were not only tested when openly exposed to the sterilizing atmosphere, but also inside of defined gaps to challenge the penetration capability of the VPHP into small lumens under diffusive conditions. Different construction materials were inoculated with defined spore populations to investigate the resistance behaviour of the spores on varying surfaces. Supplementary the physico-chemical characteristics of the respective materials were analyzed in detail to draw conclusions regarding correlation of surface quality and inactivation properties.
The results demonstrate that the decisive factor for a successful decontamination is the overall microscopic interaction with the bioburden on the surface. It is shown, that the microcondensation in the sub-visible range is effective for good inactivation performance and that further condensation in the visible range does not enhance the microbicidal activity. The data illustrate that the microbial inactivation is accelerated by increasing hydrogen peroxide concentration. An H2O2 level of 800 ppm ensures a sufficient deposition of sterilant onto the surface and results in excellent and reproducible kill. For sterilant levels > 800 ppm no further improvement in inactivation is detectable. It is shown that for openly exposed BIs a lower H2O2 level (400 ppm) can be compensated by higher humidity. The elevated water content in the decontamination atmosphere promotes the sterilant deposition. The higher the hydrogen peroxide level is, the more independent from humidity becomes the inactivation effect. For H2O2 levels of 800 ppm, the microbicidal activity of the VPHP is found to be independent from the water concentration.
In contrast to the openly exposed BIs, for the inactivation of spores exposed under diffusive conditions inside of gaps, a lower hydrogen peroxide level can not be compensated by higher humidity. Solely the hydrogen peroxide concentration and the overall cycle duration are able to influence the decontamination success inside of the trenches. It is demonstrated that in principle complex structures can be decontaminated by the means of VPHP but the penetration capability is limited. The inactivation is impeded with decreasing gap cross section and with increasing gap depth. It is shown that different construction materials and surface textures have an impact onto the resistance behaviour of spores towards VPHP.
In der pharmazeutischen Industrie müssen sterile Medikamente, die nicht terminal sterilisierbar sind, unter aseptischen Bedingungen gefertigt werden. Hierfür können Isolatorsysteme, die den Verarbeitungsprozess mittels physikalischer Barrieren von der Umgebung und dem Bediener trennen, verwendet werden. Bevor ein aseptischer Prozess durchgeführt werden kann, müssen die inneren Oberflächen des Isolators mit einem Sterilisationsmittel behandelt werden, um die mikrobielle Kontamination auf ein definiertes akzeptables Niveau zu reduzieren. Für diesen Zweck wird am häufigsten verdampftes Wasserstoffperoxid verwendet (Vaporized Hydrogen Peroxide, VPHP). Unterschiedliche Zyklusparameter wie die H2O2-Konzentration, Feuchtigkeit und Kondensation haben einen Einfuss auf die mikrobizide Aktivität des Dekontaminationszyklus. Darüber hinaus beeinflussen auch Designfaktoren des Isolators (z.B. Konstruktionsmaterial, geometrischer Aufbau) die Inaktivierungsergebnisse.
Die Zielsetzung der vorliegenden Dissertation war es, den Wirkmechanismus des VPHP zu untersuchen, um eine Empfehlung für optimale Dekontaminationsbedingungen zu entwickeln. Darüber hinaus sollte der Einfluss von unterschiedlichen Konstruktionsmaterialien und Oberflächengüten sowie von geometrischen Strukturen auf die Inaktivierungsleistung des VPHP hin zu untersuchen.
Für die Untersuchungen wurde ein pharmazeutischer Isolator mit VPHP-Generator verwendet. Es wurden standardisierte Dekontaminationszyklen mit verschiedenen Peroxid- und Wasserkonzentrationen sowie Zykluszeiten entwickelt. Bioindikatoren (BIs) mit definierten Ausgangspopulationen von Geobacillus stearothermophilus Sporen wurden während der verschiedenen Dekontaminationszyklen exponiert. Über die Bestimmung von Inaktivierungskinetiken für die Test-Mikroorganismen konnte die sporizide Wirksamkeit jeder Kombination von Zyklusbedingungen ermittelt werden. Die verwendeten mikrobiologischen Methoden waren die ?Most Probable Number? MPN- sowie die D-Wert-Bestimmung. Die BIs wurden im Isolator nicht nur offen exponiert getestet, sondern auch exponiert innerhalb von Spalten. Dabei sollte das Eindringverhalten des VPHP in kleine Öffnungen untersucht werden. Verschiedene Konstruktionsmaterialien wurden mit definierten Ausgangspopulationen von Sporen beimpft, um das Resistenzverhalten der Mikroorganismen auf unterschiedlichen Oberflächen zu prüfen. Zusätzlich wurden die physikalisch-chemischen Eigenschaften der jeweiligen Materialien untersucht, um Rückschlüsse auf eine Korrelation von Oberflächencharakteristika und dem Resistenzverhalten der Sporen zu ermitteln.
Die Ergebnisse zeigen, dass mehrere Zyklusparameter die sporizide Aktivität des VPHP beeinflussen. Der entscheidende Faktor für eine erfolgreiche Dekontamination ist die mikroskopische Wechselwirkung des Sterilisationsmittels mit den Keimen auf der Oberfläche. Es wird aufgezeigt, dass die Mikrokondensation im nicht-sichtbaren Bereich entscheidend ist für eine zufriedenstellende Inaktivierungsleistung und dass darüber hinausgehende Kondensation im sichtbaren Bereich keine weitere Verbesserung der mikrobiziden Aktivität mit sich bringt. Die Daten veranschaulichen, dass die mikrobielle Inaktivierung mit steigender Wasserstoffperoxidkonzentration beschleunigt wird. Eine H2O2-Konzentration von 800 ppm stellt eine ausreichende Deposition von Sterilisationsmittel auf den Oberflächen sicher und resultiert in exzellenter und reproduzierbarer Abtötung. Für Konzentrationen > 800 ppm, kann keine weitere Verbesserung der Inaktivierung beobachtet werden. Es wird gezeigt, dass für offen exponierte Bioindikatoren eine niedrigere H2O2-Konzentration (400 ppm) durch einen höheren Feuchtigkeitslevel ausgeglichen werden kann. Der erhöhte Wassergehalt in der Dekontaminations-Atmosphäre begünstigt den Niederschlag des Dekontaminationsmittels. Je höher die H2O2-Konzentration ist, desto unabhängiger wird der Inaktivierungserfolg vom Feuchtigkeitsgehalt der Atmosphäre. Für H2O2-Konzentrationen von 800 ppm ist die mikrobizide Wirksamkeit unabhängig von der Wasserkonzentration.
Bei Indikatoren, die innerhalb von Spalten exponiert sind, kann eine mangelnde H2O2-Konzentration nicht durch eine höhere Feuchtigkeit kompensiert werden. Innerhalb der Spalten können ausschließlich die Höhe der H2O2-Konzentration sowie die Dauer des Zyklus den Dekontaminationserfolg beeinflussen. Es wird gezeigt, dass auch komplexe Strukturen mit VPHP dekontaminiert werden können, das Eindringverhalten jedoch limitiert ist. Mit sinkendem Spaltquerschnitt und mit zunehmender Tiefe der Spalten wird die Inaktivierung zunehmend erschwert. Es werden Materialien mit guter und schlechter Dekontaminationscharakteristik identifiziert und Ursachen für das ungleiche Verhalten ermittelt.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Volker
Kottke
Prof. Dr.
2010-06-29
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-5740
application/pdf
eng
http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/de/
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/574/
oai:opus.uni-hohenheim.de:573
2011-03-03T08:05:37Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Charakterisierung von Interaktionspartnern des Kernrezeptors CAR (?Constitutive Androstane Receptor?) mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie
Characterization of interaction partners of the nuclear receptor CAR (constitutive androstane receptor) by MALDI-TOF mass spectrometry
Clint
Melgar
570
konstitutiver Androstanrezeptor , Kernrezeptor, MALDI-MS
SMARCC1 , SWI/SNF Chromatin-remodling Komplex constitutive androstane receptor , nuclear receptor
Der konstititutive Androstanrezeptor (constitutive androstane receptor; CAR; NR1I3), ein Kernrezeptor, spielt eine entscheidende Rolle in der Induktion des Arzneimittelmetabolismus und -transports durch Aktivatoren vom Phenobarbital-Typ. Die hepatische Expression zahlreicher arzneimittelmetabolisiernder Enzyme der Phase I und Phase II sowie von Transportproteinen wird durch CAR als Antwort auf diverse Chemikalien induziert. Neben seiner Funktion in der Entgiftung von Fremdstoffen ist CAR auch involviert in andere hepatische Funktionen wie Fettsäureoxidation, Glukoneogenese und die Sekretion von Steroidhormonen und Bilirubin. In primären Hepatozyten ist CAR vorwiegend im Cytoplasma lokalisiert und mit anderen Proteinen in einem großen Multimerkomplex assoziiert, dessen Komponenten noch nicht vollständig identifiziert wurden. Durch Aktivatoren wie Phenobarbital dissoziiert CAR von bekannten Proteinen des Multimerkomplexes, dem cytosolischen CAR-Retentionsprotein (CCRP) und dem Chaperon HSP90. Dies führt nach Dephosphorylierung durch die Proteinphosphatase 2A (PP2A) zur Translokation in den Nukleus, wo CAR mit dem Retinoid-X-Rezeptor (RXR) heterodimerisiert. CAR-RXR bindet an die entsprechenden DNA-Bindungsstellen in der regulatorischen Region der Zielgene und rekrutiert Ko-Aktivatoren wie SRC-1 (Steroidrezeptor Ko-Aktivator), GRIP1 (Glutamatrezeptor interagierendes Protein) und PGC-1 (Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor γ Ko-Aktivator 1), um die Gentranskription zu induzieren.
Ziel dieser Arbeit war es, den in der Leber exprimierten Kernrezeptor CAR auf putative Interaktionspartner zu untersuchen, um eventuell Hinweise auf Aufbau und Regulation des nativen Proteinmultimerkomplexes zu erhalten und um die Funktion von CAR besser verstehen zu können.
Zu diesem Zweck wurde ein in vitro Pulldown-Assay mit Leberhomogenat zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen von CAR etabliert. Als ersten Schritt wurden GST und GST-CAR-LBD-Fusionsproteine generiert, die in E. coli Bakterienzellen exprimiert und anschließend affinitätsgereinigt wurden. Die Fusionsproteine wurden mit Leberhomogenat inkubiert und gebundene Proteine mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Nach Visualisierung mit Silbernitrat wurden die Proteinbanden ausgeschnitten und für die Massenspektrometrie präpariert. Neue Interaktionspartner von CAR wurden über die massenspektrometrische MALDI (Matrix assisted Laser Desorption/Ionisation)-Methode identifiziert.
Nach Optimierung der Pulldown-Methode wurden diverse Strukturproteine, Transportproteine und Enzyme signifikant als putative neue Interaktionspartner von CAR identifiziert, u.a. das Hitzeschockprotein 70, die Pyruvatcarboxylase, GAPDH, Carbonylreduktase, Lamin A, Phosphatidylinositol Transferprotein 1 und BAF 155 (BRG1-assoziierter Faktor).
Als besonders interessanter potenzieller Interaktionspartner von CAR wurde das Protein BAF 155 im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht. Dieses Protein ist Bestandteil eines Säuger-SWI / SNF Chromatin-?remodeling? Komplexes, der in fundamentalen zellulären Prozessen wie Transkription, Replikation und Reparatur von Chromatin eine wichtige Rolle spielt. Die Interaktion des GST-CAR Fusionsproteins mit BAF 155 wurde mit verschiedenen Methoden wie in vitro GST-Pulldown-Assay und in vivo Immunpräzipitation bestätigt. Im Western Blot wurde BAF 155 in den Pulldown-Proben mit Leberhomogenat ebenfalls nachgewiesen. Eine funktionelle Analyse der Interaktion mittels RNA-Interferenz war leider nicht erfolgreich, da die Methode aus Zeitgründen nicht mehr erfolgreich optimiert und validiert werden konnte. Zusammenfassend konnte der Pulldown-Assay, kombiniert mit massenspektrometrischen MALDI-TOF Analysen, als eine reproduzierbare Methode zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen etabliert werden und lieferte diverse neue putative Interaktionspartner von CAR. Das in dieser Arbeit identifizierte Protein BAF 155 bzw. der ganze SWI / SNF Komplex könnten eine wichtige Rolle in der CAR-induzierten transkriptionalen Aktivierung spielen.
The human nuclear receptor ?constitutive androstane receptor? (CAR; NR1I3) plays a pivotal role in the induction of drug metabolism and transport by phenobarbital-type inducers. The hepatic expression of phase I and phase II drug metabolizing enzymes and of transporters is activated by CAR in response to structurally diverse chemicals. In addition to xenobiotic detoxification, activation of CAR is also involved in other hepatic functions like fatty acid oxidation, gluconeogenesis, clearance of steroid hormones and bilirubin. In primary hepatocytes, CAR resides predominantly in the cytoplasm associated with other proteins in a multimeric complex of which some components still remain to be identified. Upon exposure to inducers CAR dissociates from the already identified proteins of the complex, the cytosolic CAR retention protein (CCRP) and HSP 90 resulting in its translocation into the nucleus, where it heterodimerizes with the retinoid X receptor (RXR). The CAR-RXR heterodimer binds to its respective response elements in the regulatory region of target genes and recruits coactivators like SRC-1 (steroide receptor co-aktivator), GRIP1 (glutamate receptor interacting protein) and PGC 1 (peroxysom-proliferator-aktivated receptor γ co-activator 1) to induce gene transcription. To better understand the function of CAR, this study was focused on the identification of proteins which associate with CAR.
The aim of this work was to identify putative interaction partners of the nuclear receptor CAR which are expressed in liver to get additional information on structure and regulation of the native protein multimer complex und to obtain a better understanding of the functionality of CAR.
Hence, we have established an in vitro pulldown assay with liver homogenate to analyze protein-protein interactions of CAR. As a first step we generated GST and GST-CAR fusion proteins which were expressed in E. coli followed by affinity purification. Then we incubated the fusion proteins with total liver homogenate and separated bound proteins with SDS-PAGE. After visualization with silver staining, the protein bands were excised and prepared for mass spectrometry. For identification of new interaction partners of CAR in liver, the Matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF) was used.
After optimization of the pulldown assay we could identify several proteins like cytoskeletal proteins (e.g. lamin A), enzymes (e.g. pyruvate carboxylase, GAPDH) and chaperones (e.g. HSP 70) as binding to CAR.
As an especially interesting interaction partner of CAR we decided to further investigate the interaction of CAR with BRG1-associated factor (BAF) 155. This protein is a component of the mammalian SWI / SNF chromatin remodeling complex that plays an important role in fundamental cellular processes such as transcription, replication, and the repair of chromatin. Interaction of GST-CAR-LBD fusion protein was confirmed by additional methods like pulldown assay of GST-CAR with (35S)-methionine labeled BAF 155 in vitro and co-immunoprecipitation of the two proteins. Additionally, we could confirm BAF 155 interaction with CAR by Western blotting of the original pulldown samples. Analyzing the interaction of CAR and BAF 155 with RNA interference was not successful, since the method could not be optimized and validated appropriately, due to time constraints.
In conclusion, we were able to establish a highly reliable and reproducible assay to investigate protein interactions resulting in the significant identification of new interaction partners of CAR. Regarding the identified CAR interaction partner BAF 155, this protein or the complete SWI / SNF complex could play a functional role in CAR-mediated transcriptional activation, however further research is needed to establish the role of BAF 155 in CAR function.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Lutz
Graeve
Prof. Dr.
2011-01-27
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-5731
application/pdf
ger
http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/de/
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/573/
oai:opus.uni-hohenheim.de:583
2011-03-16T11:15:14Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Molekulargenetische Untersuchungen zur Expression des Typ III Effektors NleA 4795 von Shiga Toxin-produzierenden Escherichia coli
Molecular genetic examinations of the expression of type III effector NleA 4795 in Shiga toxin-producing Escherichia coli
Maike
Schwidder
570
STEC , Virulenzfaktor , Genregulation , EHEC
nicht-LEE kodierter Effektor , NleA, Locus of Enterocyte Effacement , Typ III Sekretionssystem non-LEE encoded effector , NleA, locus of enterocyte effacement , type III secretion system
Shiga Toxin-produzierende E. coli (STEC) gelten weltweit als wichtige Erreger von lebensmittelbedingten Infektionen und können zu schweren Erkrankungen wie der hämorrhagischen Colitis und dem lebensbedrohlichen hämolytisch-urämischen Syndrom führen. Die Bakterien kolonisieren den Dickdarm des Menschen, wo sie in der Regel zur Ausbildung von charakteristischen ?Attaching und Effacing?-Läsionen führen. Verantwortlich dafür ist eine Pathogenitätsinsel, bezeichnet als ?Locus of Enterocyte Effacement? (LEE), sowie die darauf kodierten Komponenten eines Typ III Sekretionssystems, über das die Bakterien Effektorproteine direkt in die Wirtszellen injizieren können. Zusätzlich zu den LEE-kodierten Effektoren existiert eine große Anzahl an Effektorproteinen, deren kodierende Sequenzen außerhalb der Pathogenitätsinsel lokalisiert sind. Darunter auch der ?Non-LEE encoded Effector A? (NleA), der im Genom von kryptischen oder induzierbaren Prophagen kodiert ist und unter den pathogenen E. coli Stämmen weitverbreitet vorkommt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression und Regulation der nleA-Variante nleA4795 des E. coli O84:H4 Stammes 4795/97 untersucht, welche auf dem Shiga Toxin-konvertierenden Phagen BP-4795 lokalisiert ist. Dabei wurde mit Hilfe eines Luciferase-Reportersystems und der quantitativen Real-Time PCR der Einfluss von verschiedenen Umweltreizen getestet sowie die Abhängigkeit der nleA4795-Expression von bestimmten Regulatorproteinen untersucht. Unter den analysierten Umweltbedingungen kristallisierten sich bestimmte NaCl- und KCl-Konzentrationen als induzierend für die Expression von nleA4795 heraus und lassen daher auf eine osmotisch bedingte Aktivierung schließen. Eine zunächst vermutete Induktion der nleA4795-Expression durch Quorum Sensing in vorkonditioniertem Medium konnte nicht nachgewiesen werden, da keiner der bislang bekannten Autoinducer einen positiven Einfluss ausübte. Die erhöhte Expression von nleA4795 konnte nachfolgend mit einem reduzierten Nährstoffgehalt assoziiert und somit eine Korrelation zwischen der nleA4795-Expression und bakteriellen Stressantwort-Systemen hergestellt werden. Des Weiteren wurde untersucht, ob ein Zusammenhang zwischen der nleA4795-Expression und der Induktion des Phagen BP-4795 sowie der damit verbundenen Expression von Shiga Toxin besteht. Durch Induktionsexperimente mit Norfloxacin konnte jedoch im Gegensatz zur Expression von Shiga Toxin keine Aktivierung, sondern eine starke Repression der nleA4795-Expression nachgewiesen werden.
Die Untersuchungen auf regulatorischer Ebene zeigten die Abhängigkeit der nleA4795-Expression von den drei LEE-kodierten Regulatoren Ler, GrlA und GrlR sowie von den außerhalb des LEE kodierten Pch-Regulatoren. Für den ebenfalls außerhalb der Pathogenitätsinsel kodierten Regulator EtrA konnte kein Einfluss auf die Expression von nleA4795 nachgewiesen werden. Zudem wurden die Regulatorproteine Ler, GrlA und PchA mit Hilfe von Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) auf eine direkte Bindung an die nleA4795-Promotorregion untersucht. Die beiden Regulatoren GrlA und PchA zeigten jedoch keine spezifische Bindung und wurden demzufolge als indirekte Regulatoren der nleA4795-Expression einstuft. Für den Regulator Ler konnte hingegen eine direkte Bindung an bestimmte Bereiche der nleA4795-Promotorregion nachgewiesen und somit eine Integration von nleA4795 in den Ler-vermittelten Regulationskreis des LEE bestätigt werden.
Shiga toxin-producing E. coli (STEC) are the causative agents of foodborne infections in many countries and can lead to severe diseases like hemorrhagic colitis or the life-threatening hemolytic uremic syndrome. The bacteria colonize the human intestine where they normally cause the formation of characteristic ?attaching and effacing?-lesions. Essential for this effect is a pathogenicity island, termed as ?locus of enterocyte effacement? (LEE), that encodes the components of a type III secretion system and several effector proteins, which are translocated directly into the host cells by the TTSS machinery. In addition to the LEE-encoded effectors a large number of effector proteins have been identified which are encoded outside of the pathogenicity island. Among these is the ?non-LEE encoded effector A? (NleA), which is encoded on cryptic or inducible prophages and is widely distributed among pathogenic E. coli strains.
In the present study, the expression and regulation of the nleA-variant nleA4795 of E. coli O84:H4 strain 4795/97 was investigated, which is located on the Shiga toxin-converting bacteriophage BP-4795. Therefore, different environmental conditions as well as certain regulatorproteins were tested on their influence on nleA4795-expression using a luciferase-reportersystem and the quantitative real-time PCR. Among the analyzed environmental factors, certain concentrations of NaCl and KCl were identified to activate nleA4795-expression, indicating an osmotic-based influence. The suggested induction of nleA4795 in preconditioned medium due to quorum sensing could not be confirmed, since none of the so far known autoinducers showed a positive influence on the expression. The increased expression of nleA4795 could be associated with a reduced amount of nutrients in subsequent investigations and therefore demonstrated a relation between nleA4795-expression and bacterial stress-response-systems. Furthermore, a possible correlation of nleA4795-expression with the induction of phage BP 4795 and Shiga toxin-expression was analyzed. Different from the expression of Shiga toxin, induction-experiments with norfloxacin showed no activation, but a strong repression of nleA4795-expression.
Analysis of the regulatory level demonstrated that the expression of nleA4795 depends on the three LEE-encoded regulators Ler, GrlA und GrlR as well as on the Pch-regulators, which are encoded outside of the LEE. The non-LEE encoded regulator EtrA showed no influence on the expression of nleA4795. In addition, the regulator proteins Ler, GrlA and PchA were tested for direct binding to the nleA4795-promoterregion. Regulators GrlA and PchA showed no specific binding and were therefore classified as indirect regulators of nleA4795-expression. In contrast, regulator Ler showed a specific binding to different areas of the nleA4795-promoter region and thereby confirmed the integration of nleA4795 in the Ler-mediated circuit of LEE-regulation.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Herbert
Schmidt
Prof. Dr.
2011-02-24
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-5832
application/pdf
ger
http://creativecommons.org/licenses/by-nd/3.0/de/
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Naturwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/583/
oai:opus.uni-hohenheim.de:592
2011-04-12T10:28:48Z
ddc:570
pub-type:8
has-source-swb:false
Development of assessment tools for Lake Sevan (Armenia) by the application of remote sensing data and geographic information systems (GIS) techniques
Entwicklung von Bewertungsinstrumenten für den Sevan See (Armenien) unter Anwendung von Fernerkundungsdaten und GIS-Techniken
Thomas Kwaku
Agyemang
570
Fernerkundung , Geoinformationssystem , Litoral
Sevansee , Landschaftsmaße , Habitateignungsmodell Lake Sevan , littoral , landscape metrics , habitat suitability models
Lake Sevan is the biggest source of water in Armenia. Its littoral zone, in addition to being a food source and a substrate for macrophytes, algae and invertebrates, provide refuge and spawning habitats for both young & old organisms especially fishes. Between 1933 and 1960s, the lake level had been lowered by 20 m below the original level by increasing the lake outflow intermittently for irrigation and electricity generation. This evidently had ecological and economical consequences on the lake ecosystem.
The importance of assessing the accuracy of spatial data classifications derived from remote sensing methods and used in geographic information system (GIS) analyses has been regarded as a critical component of many projects. In this project, supervised classified QuickBird satellite imageries of both submersed macrophytes and landcover types (emersed vegetation) of the Gavaraget, Tsovazard and Masrik Regions of the study area were validated in a GIS environment. The results of these assessments were represented by error matrices presenting the overall accuracy, the user and producer accuracies in each category, as well as the kappa coefficients.
For submersed macrophytes at the vegetation level, the overall accuracy ranging between 77-88% was achieved in all the investigation years. Alga blooms in the different years impacted on the accuracy of the classification. However, even through severe algal blooms user accuracies between 55% and 95% were achieved. On the other hand, at the growth type level, the overall accuracy was as high as over 70% and as low as below 49%.
For emersed vegetation types, predominantly high overall accuracies of more than 70% were obtained in 2 of the investigation years. Above all, in 2008, only slight overall accuracy could be obtained. For reeds areas, high user accuracies of more than 78% could be obtained, while for shrubs, trees, no vegetation and grasses in the different years, very different classification accuracies were attained.
Two habitat suitability models (one for fishes and one for birds) were built in a GIS environment in this project. While the Crucian Carp (Carassius auratus Gibelio Bloch) was chosen as lead species for the fish habitat, the Common Coot (Fulica atra) and the Great Crested Grebe (Podiceps cristatus) were chosen for the bird habitat models based on expert knowledge on Lake Sevan.
Five fish habitat suitability classes were assigned in the model. There was a similar trend in the fish habitat areas in all the landscapes in Gavaraget, Tsovazard and Masrik regions. The habitat areas increased in 2007 and decreased in 2008. The increases in all the regions were the same (around 43%) while the highest reduction occurred in Gavaraget (47%) followed by Masrik (38%) and Tsovazard (25%) respectively. Apart from the reductions in habitat areas in 2008, there were severe decreases in the quality of the habitat areas in all the regions of interests. The increases and decreases were as a result of interannual fluctuations due to water level fluctuations and algal blooms of Lake Sevan.
Also, for the bird habitat model, five classes were assigned. Tsovazard and Masrik had a similar trend in habitat areas with an initial increase in 2007 followed by a decrease in 2008. However, Gavaraget had reductions in 2007 and 2008. Again, in addition to the severe reductions in the habitat areas in 2008, there were severe decreases in the quality of the habitat areas in all the regions of interests. The changes in emersed macrophyte vegetations and the lake water level fluctuations effected the different changes in the bird habitat areas.
Der Sevansee stellt die größte Süßwasserressource Armeniens. Seine Litoralzone bietet neben Nahrungsressourcen und Substraten für Algen und Invertebraten auch Schutz- und Laichgebiete für juvenile und adulte Tierarten vor allem Fische. Zwischen 1933 und 1960 wurde der Seespiegel zur Bewässerung und Energiegewinnung um fast 20 m abgesenkt, mit drastischen Konsequenzen für das gesamte Seeökosystem.
Die Validierung der Klassifikationsgüte ist ein zentraler Bestandteil in Fernerkundungsprojekten. Innerhalb des vorliegenden Projektes wurden mittels überwachter Klassifikation von Quickbird Satellitenbildern ermittelte Bedeckungen von submersen und emersen Vegetationsstrukturen in den Untersuchungsgebieten Gavaraget, Tsovazard und Masrik der Litoralzone des Sevansees in einer GIS-Umgebung validiert. Die Ergebnisse wruden in einer Fehlermatrix präsentiert, welche Werte zur Gesamtgenauigkeit sowie zur Nutzer- und Erzeugergenauigkeit sowie Kappa-Koeffizienten zur Beurteilung der Zufallswahrscheinlichkeit des Ergebnisses beinhaltet.
Die für submerse Makrophyten für die verschiedenen Untersuchungsjahre ermittelten Gesamtgenauigkeit liegen mit 77-88% auf einem hohen Güteniveau. Algenblüten führten in einzelnen Jahren in bestimmten Gebieten zu Beeinträchtigungen der Klassifikationsgüte. Noch stärker durch Algenblüten beeinträchtigt wurde die Klassifikationsgüte in einzelnen Jahren auf dem Niveau der Wuchstypen, wo die Gesamtgenauigkeiten zwischen 55% und 95% lagen. Auf Artniveau wurden hingegen teilweise recht hohe Gesamtgenauigkeiten von über 70% erzielt, aber auch niedrige von unter 49%.
Für emerse Vegetationstypen wurden ebenfalls überwiegend hohe Gesamtgenauigkeiten von über 70% erzielt, wobei in den 2 Untersuchungsjahren die Werte allerdings stark schwanken. Vor allem im Jahr 2008 konnten in den meisten Untersuchungsgebieten nur geringe Gesamtgenauigkeiten erzielt werden. Vor allem für Schilfbestände Flächen konnten hohe Nutzergenauigkeiten von über 78% erzielt werden, während für Büsche, Bäume, unbewachsene Flächen und Grasland in den verschiedenen Jahren sehr unterschiedliche Klassifikationsgüten erreicht wurden.
Habitatmodelle ermöglichen die Beurteilung der Habitateignung für eine bestimmte Tierart innerhalb eines Untersuchungsgebietes. Zwei Habitatmodelle, eines für Fische und eines für Wasservögel, wurden innerhalb des Projektes in einer GIS Umgebung entwickelt. Während die Karausche (Carassius auratus Gibelio Bloch) als Leitart für Fischhabitate gewählt wurde, wurden die Bläßralle (Fulica atra) und der Haubentaucher (Podiceps cristatus) für die Vogelhabitatmodelle gewählt, basierend auf Expertenwissen lokaler Experten am Sevansee.
Für die Beurteilung der Flachwasserzone als Fischhabitat wurden innerhalb des Modells 5 Eignungsklassen berechnet. In allen Untersuchungsgebieten ergab sich über die Untersuchungsjahre ein ähnlicher Trend. Die Habitatflächen stiegen von 2006 nach 2007 stark an und reduzierten sich wieder nach 2008. Während die Habitatzuwächse 2007 in allen Untersuchungsgebieten in etwa gleich bei ca. 43% lagen, waren die Verluste jeweils recht unterschiedlich, in Gavaraget bei 47%, in Masrik bei 38% und in Tsovasard bei 25%. Unabhängig von den Flächenverlusten der Habitate nahm auch die Habitatqualität stark ab.
Die Schwankungen können sowohl auf den Rückgang der Makrophyten, als auch auf den Anstieg des Wasserspiegels zurückgeführt werden.
Auch für die Vogelhabitatmodelle wurden fünf Eignungsklassen gebildet. Für die Untersuchungsgebiete Tsovasard und Masrik ergaben sich zeitlich ähnliche Trends mit Habitatflächenzunahmen zwischen 2006 und 2007 und Abnahmen zwischen 2007 und 2008, wobei die Ausmaße in beiden Untersuchungsgebieten sehr unterschiedlich waren. In Gavaraget ergab sich jedoch eine stetiger Abnahme der Habitatflächen über die Untersuchungsjahre. Wie auch bei den Fischhabitaten ergab sich für 2008 auch eine starke Abnahme der Habitatqualität.
Da die ökonomische Bedeutung der Karausche für den Sevansee sehr hoch ist, leistet die GIS basierte Habitateignungsanalyse eine wichtigen Beitrag zur Entscheidungsunterstützung bei Maßnahmenplanungen und Erfolgskontrolle. Zusätzlich kann die Karausche auch als Indikator für die ökologische Funktionsfähigkeit der submersen Makrophytenstrukturen dienen. Auch die in allen Untersuchungsgebieten vorkommenden Bläßrallen und Haubentaucher können als Leitarten für die Funktionsfähigkeit der emersen Vegetationsstrukturen dienen.
Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim
Hohenheim
Garbenstr. 15, 70593 Stuttgart
Klaus
Schmieder
Prof. Dr.
2010-08-19
ElectronicThesisandDissertation
urn:nbn:de:bsz:100-opus-5923
application/pdf
eng
http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/de/
thesis.doctoral
Universität Hohenheim
Hohenheim
Fakultät Agrarwissenschaften
1
aus: Praesentationsformat
http://opus.uni-hohenheim.de/volltexte/2011/592/
1711632315649